野生型噬菌体λDNA全长约50kb，上有65种限制酶酶切点，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切点在λ增殖所必需的基因区域内。因此，噬菌体λ必须经过改造才能用作载体。现在用的λ载体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此，作为载体的噬菌体λ都短于野生型。
噬菌体λ载体有两种类型：①插入型。由于改建后的噬菌体λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影响噬菌体增殖。而且噬菌体DNA缺失越长，插入片段就可越大。②置换型。噬菌体λ的基因组可分为三个区域，左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20kb。右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12kb。中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
噬菌体λ裂解生长的能力同包装在头蛋白中的λDNA的大小有关。当DNA的长度短于野生型的78%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降。因此要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。
置换型载体DNA用选定的限制酶完全酶切后，要设法除去中间片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段连接，包装成重组噬噬体。这是因为左臂和右臂与中间片段间都有单链“粘性末端”，在连接酶作用下可以重新恢复原来的结构，从而影响了同外源DNA的连接。区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法是用Xgal蓝色噬菌斑试验。有些噬菌体载体的中间片段带有编码β半乳糖苷酸的基因。当这种噬菌体感染lac宿主细胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）的培养基上生长时，半乳糖苷酸与Xgal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。因此，含有中间片段的重新恢复的噬菌体形成蓝色噬菌斑；而同外源DNA连接的重组噬菌体形成的噬菌斑是无色透明的。
