凝集素的特性及标记原理详见第五章 ,近年来,凝集素电镜标记技术应用日益广泛,且获得较为满意的效果。凝集素电镜标记技术方法较多,常用的有凝集素—酶(常用为HRP)、凝集素—生物素—酶电镜标记技术。现将凝集素—酶电镜标记技术(包埋前染色)简介如下(Sterit 和Kreatzberg,1987)。
(1)固定:常用为PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如为取脑组织,可将已藻注动物在4℃过夜,次日取脑组织置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸钠缓冲液(含7.5%蔗糖)中漂洗。
(2)振动切片机(Vibratome)切60μm的厚片。
(3)切片孵育在PBS(内含0.1mol/l CaCl2、Mgcl2和MnCl2)10min(有作者主张此步可省略)。
(4)为增强细胞通透性,切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl2水溶液中,pH7.8,37℃孵育30min。
(5)PBS洗3次,每次2min。
(6)凝集素—HRp 1:10 在PBS中(含0.1%Triton X--100)4℃过夜,最好不断轻轻振荡。
(7)PBS洗3次,每次2min。
(8)DAB-H2O2显色。
(9)1%OSO4水溶液固定。
(10)系列酒精脱水,EPON包埋,切片。
(11)电镜沿—铀双染观察。
凝集素呈高电子密度常沉积在细胞膜上,易与电子染色相区别。