这一反应依赖于AMV逆转录酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。当逆转录酶合成cDNA第一链后，RnaseH降解模板RNA，逆转录酶合成cDNA第二链，T7RNA多聚酶以此cDNA为模板，转录出与样本RNA序列相同的RNA。其RNA扩增过程与TAS相同。由于所使用的工具酶工作的适宜温度是37℃，所以只要在第一步变性、复性后，整个反应过程不再需要温度循环。具体方法如下：制备引物A、B，引物A有T７RNA多聚酶识别、结合位点。将引物、样本加入扩增缓冲液中，65℃，1min，降温至37℃，加入人工具酶，37℃保温1h，冰浴中止反应。可用葡聚糖夹心法检测扩增产物。
这一方法有几点值得注意：（1）反应是在37℃恒温中进行的；（2）产物中有RNA，反义RNA的cDNA，RNA的拷贝数高于Cdna（90：1）；（3）效率高于PCR。使拷贝数扩增到105，PCR要85min，3SR仅要15min；（4）逆转录酶也具有RnaseH活性，反应又是在37℃中进行，因此推测某些病毒，如HIV-1感染的细胞内可能存在类似3SR的病毒基因扩增机制。
