二、加样程序

由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：

（一）平衡饱和加样程序

1．基本原理所谓平衡饱和，是指抗原和抗体反应达到再不结合，也不解离的平衡状态，称为饱和状态，即平衡饱和。所以，有人称此为饱和分析法。这意味着抗原或被测抗原、标记抗原、抗体三者一起温育。

2．加样程序一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中，标记抗原和未标记抗原与抗体结合的亲合力常常是不相同的，前者比后者的亲合力高。因此，上述加样程序就更有必要，所以一般都采用先加标准物或样品和抗血清，后加标记物。这样测定也比较稳定。

在大分子蛋白质抗原的放射免疫分析中，如果是双抗体分离法，抗原和标记抗原与抗体三者加样，可不分先后，有的是标准物、标记物、抗血清的加样顺序，但一般习惯还是标准物或血样、抗血清、标记物、然后混匀温育24～48h，再加双抗体，继续温育24h，使免疫反应达到平衡。对一些多肽激素的放射免疫分析，应用双抗体分离法，其流程比较长，这样的顺序同样可不分先后。

以大鼠垂体、下丘脑β-内啡肽RIA测定程序为例：

（1）加样（单位μl；总反应体积500μl）

标准曲线 样品
T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂体 下丘脑
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
β-EP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 / /
样品 / / / / / / / / / 1 100
β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100
125-β-EP溶液 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
缓冲液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200

（2）孵育：4℃，24h

（3）分离B与F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，摇匀，立即离心，去上清，测沉淀（F）的CPM数。

（二）顺序饱和加样程序

1．基本原理先将标准物或血样品与抗血清混匀，免疫反应6～24h，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后再加入标记抗原，与抗体反应12～24h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。

应用顺序饱和加样，可以提高测定方法的灵敏度。Utiger在做人促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析时，将标记物延至第2天加入，发现其灵敏度增加两倍。如果缩短最后的温育时间，仍可取得满意的结果。所以一般认为，在顺序饱和加样中，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。但也有相反的意见，认为顺序饱和加样，是使用过量抗体，会使灵敏度受到一定影响。如果使用抗体不过量，温育时间缩短，在抗原和抗体结合未达到平衡饱和时就加入标记物，这样既不影响加灵敏度，反而比较稳定，甚至可提高灵敏度。

2．加样程序　以人血浆精氨酸加压素RIA测定程序为例（直接测定）。

（1）加样（单位μl；总反应体积600μl）

标准曲线 血浆
T NSB Bo 1Pg 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AVP标准液 / / / 100 100 100 100 100 100 /
样品 / / / / / / / / / 300
无肽血浆 / 300 300 300 300 300 300 300 300 /
AVP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100
缓冲液 / 200 100 / / / / / / 100
在4。C下孵育12～24h
125I-AVP 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

（2）孵育：4℃，24h。

（3）分离B与F。

无肽血浆，用于血浆的直接测定。其制备方法为：在电磁搅拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共两管，离心、去上清。血浆5ml，倒入上述活性炭管中，加盖，充分振荡10min，离心，上清倒入上述另一活性炭管中，振荡10min，再离心，取上清，即无肽血浆。血浆中的生物活性物质被活性炭吸附而去除。

（三）计数、绘制标准曲线与测定样品含量

以活性炭分离B与F，沉淀计数是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm数。

计算标准管与样品管结合（B）的cpm数及与零标准管结合（B）的比（B/B×100%）。

用半对数纸，以标准管的B/B为纵座标，以各标准管含量为横座标，绘制标准曲线。

根据样品的结合率（B/B×100%），从标准曲线中找出被测样品抗原的含量，再换算成每毫升血浆含某抗原的量，或每毫克（组织湿重）含某抗原的量。