四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法

此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液，两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l （pH6.0），加入对苯二酚，使终浓度为1mg/ml。将DNA用超声打成500～800bp长度的片段，煮沸法变性，取1份DNA与9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5）在40℃下充分透析，浓缩DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5），再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）在40℃下充分透析，纯化，-20℃保存。