（一）大肠杆菌质粒

应用的最广泛的质粒载体是pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定，基本结构如图23-3。

当需要用pBR322来克隆BamHI酶切的一个DNA片段时，一般的做法是如图23-4所示。

pBR322克隆DNA片段的程序

图23-4　pBR322克隆DNA片段的程序

从图23-4可见，外源DNA片段同pBR322都经Bam HⅠ酶切，所以有相同的单链“粘性末端”，通过DNA连接酶可以构成重组DNA分子。由于pBR322的BamHⅠ酶切点在四环素的抗性基因中，所以Bam HⅠ酶切后使这个抗性基因失活。如果酶切后的质粒pBR322自身又重新连接，则恢复对四环素的抗性，转化子就仍然具有对二种抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA，则转化子失去了四环素抗性表型，而只有对氨苄青霉素的抗性，这样就可根据转化子的抗性而把重组质粒转化的细菌选出，然后扩增细菌，大量回收质粒DNA，从而达到大量扩增外源DNA的目的。