十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法

此法标记原理如下图所示：

辣根过氧化物酶标记核酸探针法

标记的HRP部分催化底物化学发光反应：氨基苯二甲酰肼氨基苯二甲酸

+N2+光→X-光片上感光10～20min显定影。

光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下，而使光亮增强。

这种方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把产生的能量转变为光能放出，称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂，经增强剂将光能放大，在X光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当，简便快速，安全，是一种特异性好的检测手段，具有广泛的应用前景。

HBV-DNA的HRP标记方法：质粒中插入HBV全基因组DNA，长3.2kb，载体为PBR322质粒，4.3kb。将质粒DNA用三蒸水稀释成10ng/μl，取20μl放入EP管，100℃变性5min，加入20u HRP标记试剂，混匀，加入戊二醛20μl混匀，37℃10min，此时可立即使用，或放在冰浴中10～15min内使用，或加入50%去离子甘油-20℃保存供分子杂交用，可存放6个月。