（一）探针的选择
根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针（80～150bp）具有较大的优越性。
在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。这种方法十分简便，无论基因组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。
（二）探针的标记方法
在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。
（三）探针的浓度
总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。
（四）杂交率
传统杂交率分析主要用于DNA复性研究，在这种情况下，探针和靶链在溶液中的浓度相同。现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条件下进行，此外，固相杂交中靶序列不在液相，故其浓度不能精确计算。因此，本文不讨论通常用于杂交反应的传统二级速率公式，而叙述一级动力学公式。
在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形，双链探针开始时（1～4h），杂交动力学相同，但长时间杂交后，由于探针本身的复性，可用于杂交的探针浓度会逐渐降低。公式（1）可用于估计半数探针与固定靶序列杂交所需的时间。
t1/2=ln2/kc
t=保温（杂交）时间（s）；k =形成杂交体的速率常数[mol/(Lxntxs)]；c =溶液中的探针浓度（mol/L）。速率常数K决定于探针长度（L）、探针复杂度（N）、温度、离子强度、粘度和pH。不含重复序列的探针，l =N。例如，对一个含两个20nt序列的40mer探针而言，l=40，N=20。K与这些变量的关系为：
Kn= 3.5×105K=KnL0.5/N (2)
Kn是缔结常数，Kn =3.5×105。Na+浓度为0.4～1.0mol/L, Ph5～9和杂交温度低于探针-靶序列杂交体Tm值2.5℃时，公式（1）和（2）可合并为（3），用于计算半数探针与靶序列的杂交率（以秒计）。
对一个长500个碱基的探针而言，此值为：
长500个碱基的探针杂交时间很长（20h），应用短探针和使用杂交促进剂有其优越性。由于实际应用的探针长度变化较大（对＞1kb的探针，因扩散与粘度效应不可能使因素L得到合适的补偿）。另外，固靶序列也不可能都用于杂交，所以，由公式预计的随探针长度增加的杂交率不一定总是正确的。
（五）杂交最适温度
杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。如两个同源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。最适复性温度（Optimunm renaturationtemperature, TOR）：Tor =Tm –25℃
苛刻复性温度：Ts = Tm – (10或15℃)
非苛刻复性温度：Tns =Tm – (30或35℃)
在2×SSC反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃。
表18-4 DNA—DNA杂交温度的选择范围（2×SSC）
| DNA中G+C mol% | 杂交反应温度（℃） | ||
| TOR | Ts | Tns | |
| 30 | 62.3 | 73.3 | 52.3 |
| 35 | 64.9 | 74.9 | 54.9 |
| 40 | 67.4 | 77.4 | 57.4 |
| 45 | 70.0 | 80.0 | 60.0 |
| 50 | 72.5 | 82.5 | 62.5 |
| 55 | 75.1 | 85.1 | 65.1 |
| 60 | 77.6 | 87.6 | 67.6 |
| 65 | 80.2 | 90.2 | 70.2 |
| 70 | 82.7 | 92.2 | 72.7 |
| 75 | 85.3 | 95.3 | 75.3 |
可以看出DNA复性和DNa–RNA, DNA-DNA杂交通常要在高温反应条件下进行,其反应的最大速度是在低于Tm值约25℃。然而对于那些反应时间需要延长,或对生物活性必须保护的复杂生物的核酸研究(如哺乳动物),核酸长时间处于高温下很显然是不利的。这会引起核酸链的断裂、胶嘌呤的作用，结合到膜上的DNA脱落也会增多。这个问题可以通过使用高浓度盐溶液（如6.2mol/l NaCl），或使用某些有机溶剂的水溶液降低反应温度来解决。常使用的有机溶剂有两类，甲酰胺和二甲亚砜（DMSO）。在杂交液中加入30%二甲亚砜可使T2噬菌体DNA的Tm值比原先降低14℃，而使用酰胺甚至可使DNA在室温下变性和复性。Mc-Conaughy等发现，反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72℃。
现在认为，适当选择甲酰胺和盐水浓度及合适的反应温度，可使DNA复性和DNA-RNA杂交获得高特异性和更快的反应速度。
（六）杂交的严格性
影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。一般认为在低于杂交体Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。由此式可见，通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。对用20个碱基以上的探针做DNA：DNA杂交的Tm值计算如下：
n =杂交体中最短链的长度，因此，对一个G+C为42%的500个碱基探针于5×SSC（0.75mol/l Na+）和50%甲酰胺杂交的Tm 值为：
T=81.5 +(-2.07)+ 17.22 –1 –(30.5)=65℃
T杂交 =65℃–25℃=40℃
影响TM值的其它因素：
（1）对克隆或合成探针而言，同源性每下降1%，Tm值就降低1.5℃，15～50个碱基的寡核苷酸探针的这种作用更明显。
（2）RNA：DNA杂交体的Tm值较同样的DNA：DNA杂交体的高10～15℃。
（3）RNA：RNA杂交体的Tm值较同样的DNA：DNA杂交体的高20～25℃。
显然，当用RNA为靶序列时，要使用甲酰胺来降低Tm 值以保证合适的杂交温度。当以克隆的探针进行膜杂交时，在最后的漂洗步骤中应达到最严格的条件。对一个500个碱基探针而言，典型最终漂洗条件点0.1×SSC（0.015mol/l Na+）,55℃。代入公式（4）可得：
Tm =81.5 (-30.3) +17.22 –1-0 =67℃
67℃-55℃=12℃
因此，较Tm低12℃的漂洗条件比Tm 低25℃的杂交相比条件更严格了。
对寡核苷核探针而言，杂交温度往往低于Tm5℃，因此，对一个G+C为50%的30nt寡核苷酸探针来说，Tm 值为：
T杂交=55℃-5℃=50℃
下面一个经典的公式适用于14-20个碱基的寡核苷酸探针：
Tm =4℃（g + C） +2℃（a + T）
在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含不同稀释度靶DNA和非特异靶DNA（如鱼精或大肠杆菌DNA）的膜。在不同温度下使膜与探针杂交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶序列与探针无任何反应的温度就是最适温度，在某些条件下，可用二甲亚砜（DMSO）代替甲酰胺来降低Tm值。
用一个以上的探针的（如夹心杂交）杂交系统中，估计Tm值更加复杂。可用上述公式估计每一探针的Tm 值。然后求其均值作为杂交温度。
（七）杂交反应时间
在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。Cot=0，基本上没有 杂交。例如在液相杂交中未标记的DNa 400μg/ml（按单股DNA每微克 紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8, 杂交完成了。对标记Dn A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。
（八）杂交促进剂
惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。因此，使用促进剂时有必要优化条件。另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90000）。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
