一、白细胞的免疫荧光标记技术

1．白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞（见表10-2）。

表10-2　WHO对白细胞分化抗原的命名

a：急性淋巴细胞性白血病；b：慢性淋巴细胞性白血病。

2．样品的制备供FCM分析的样品是单细胞悬液，而且大部分样品都需经荧光染色。样品的制备方法大致有三种：①用荧光单克隆抗体染全血，随后溶解红细胞；②红细胞溶解后染色；③通过梯度离心法分离出单个淋巴细胞和单核细胞，再将之制成细胞悬液染色。

（1）全血染色后溶解红细胞：由于不少血液标本具有生物危害性，用此方法可以将染色、溶解、固定、分析几个步骤都在一个试管内进行，这样减少转换过程中的污染。而且此法比用梯度离心分离出单个核细胞更节　省时间。由于此法未将粒细胞去除，故在用FCM分析时，要注意排除粒细胞的干扰。

具体操作步骤如下：

①全血100～150μl，放入5ml试管，并用50～100μl PBS稀释，总体积为200μl。]

②荧光标记的单克隆抗体染色30min，4^℃（或放于冰上）。单克隆抗体的浓度因不同来源差异很大，但为了使用方便，可按其说明书配成每次实验使用10μl。注意蔽光。

③用3～4μl冷BPS清洗。离心250×g（约每分钟1500转），5min，洗3次。注意每次用吸管将上清吸出，决不能倾倒去液！

④用2ml氯化铵液（配法见下）在室温下溶解红血球，约10min。若红细胞完全被溶解，溶液由混浊变到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解过分，则导致白细胞上抗原被破坏，或者某些敏感的细胞死亡而导致比例的改变。若溶解不彻底，大量红细胞会影响对淋巴细胞的分析。这是因为淋巴细胞在分析图像上与红细胞群接近，在框出淋巴细胞群时，会把部分红细胞框定于淋巴细胞内。而红细胞溶解不足或过度在很大程度上影响着分析结果。

【氯化铵液的配制】

Tris—氯化铵1×氯化铵

0.16mol/L 　NH₄Cl 0.38g/100ml　 　90ml0.16mol/LNH₄Cl

0.17mol/L 　Tris 2.06g/100ml 10ml0.17mol/l Tris

pH值7.56 pH值7.2

⑤红细胞被彻底溶解，加入1mlPBS稀释的0.5%甲醛，立即离心，洗3次，条件同步骤③。加入甲醛的目的是尽早固定细胞和细胞上的抗原，避免有生物危害的标本到处污染。

⑥将染色完成的细胞悬浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液内。置4^℃，蔽光，等待分析。经固定后的细胞在冰箱内可保存一周，这样对工作的安排会带来方便。

（2）红细胞被溶解后再对白细胞染色：此方法的优点是可以了解被染白细胞的数量以及存活率。但由于有时有些标本比较敏感，溶解红细胞后，还要经过多个染色步骤，这样容易造成抗原的丧失。此法具体步骤如下：

①室温下放入14ml氯化铵在15ml的试管里。

②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

③立即离心100～150×g，并用PBS洗2次。

④白细胞计数，注意存活率应在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白细胞悬浮液。将细胞分配到5ml的试管，每试管0.2ml，即1×10⁶个细胞。

⑤荧光标记的单克隆抗体染色30min，4^℃，避光。抗体浓度配制如前所述。

⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

（3）用Ficoll—Hypaque梯度离心法分离出单个核细胞：用此法可以分离骨髓细胞、淋巴结、扁桃体捣碎后的单细胞悬液等。血液标本应有抗凝剂。取血到分离不能超过6h。

①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀释。

②稀释血8或40ml置于15或50ml离心管内，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分离液，比重为1.007）从离心管底部轻轻加入到血的下面。这种方法对血的扰动较小，比将全血加到Ficoll上面为好。加完后，可以清楚看到Ficoll与全血之间有一明显的分界线。注意在Ficoll快加完时应特别小心，否则有可能加入气泡搅混血样，使血与分离液混合，达不到分离的目的。

③离心350～400g,30min。红细胞、粒细胞以及死细胞将位于离心管底部，中间层的单个核细胞为淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。

④取出中间层中所有细胞，若在Ficoll中还有细胞也要取出，这也是单个核细胞（PBMC）。

⑤用PBS洗3次，第1次清洗时，可用较快速400×g离心10min。因为有可能中间层中混有一些ficoll，比重增加而细胞不易沉降。

⑥PBMC计数，注意存活率应高于90%。配成5×10⁶个/ml的细胞悬浮液。

⑦取出0.2ml的悬浮液加入到5ml试管（内含1×10⁶细胞），用荧光标记的单克隆抗体染色，方法如前。洗3次后固定。注意必须先染色后固定，固定后的细胞膜通透性改变，会导致荧光标记的抗体进入细胞中去，而在显微镜下观察的染色效果则和死细胞一样。当用FCM分析时，则均为阳性而达不到检验目的。这也是用FCM分析的细胞存活率应高于90%的原因。

（4）荧光标记抗体的细胞染色：如前所述，FCM分析被荧光标记的抗体染色的细胞，在选择荧光染料时必须注意这些荧光染料所需要的激发光波长是否与所使用的FCM的激发光谱相匹配。一般各个公司所采用的绿色荧光染料为FITC，而选用的红色荧光染料却不尽相同，有的用TRITC，有的用藻红蛋白（PE），所需要的激发光谱就不一样，因而若因匹配不当则会招致荧光抗体所染的细胞分析不出来，这是应该注意的。

这里的标本染色方法和免疫荧光法相同。下面仅说明一些具体的注意事项：

①在用间接法染色时，染色步骤依次为第一抗体→清洗→第二抗体→清洗→红细胞溶解。为了实验的方便，将第二抗体也配成每次实验用10μl。

②双色法：双色法多用于直接染色法。将分别用FITC和PE标记的抗体各10μl置入同一个含有约1×10⁶/0.2ml的试管内，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

目前不少制备单克隆抗体的公司已将比值有意义的两种抗体，分别用红、绿荧光染料标记后，制成一种试剂。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等。可按说明使用，具体用量为每次实验10μl。

③对照组：众所周知，免疫组化的染色过程中，阴性和阳性对照是必不可少的。在准备用FCM分析的细胞时，对照标本的制备显得格外重要。因为一次用FCM分析的样品可能会很多，甚至多达上百个试管。对同一病人也可能会用到20～30个不同的单克隆抗体。每一个病人都要有相应的阴性对照。阴性对照主要用于仪器分析细胞之前，设立阴性和阳性的分界线。阳性对照主要用于检查染色方法。阳性对照细胞选自那些已知的细胞和已知的单克隆抗体中的阳性反应最明显者。阴性对照细胞有以下几种：

1）非染色细胞：直接染色法时，用10μlPBS代替与荧光结合的单克隆抗体，其它步骤相同。间接染色法时，分别用10μl的PBS代替第一抗体和荧光第二抗体，其它步骤相同。

2）使用非特异性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特异性的单克隆抗体。这是由于所使用的单克隆抗体来自小鼠，可能造成非特异性的假性反应，因此使用MsIg作为对照。同时还需要注意选择与实验用单克隆抗体亚类一致的MsIg。如大部分单克隆抗体为IgG1，也有部分抗体为IgM，所以用MsIg作对照组时，往往使用MsIgG和MsIgM两种。直接染色法时，用10μl与荧光结合的MsIg，代替荧光单克隆抗体。间接染色时，用10μl无荧光的MsIg代替第一抗体。其它步骤与实验组相同。

3）双染色对照：将各10μl 的分别与红荧光染料和绿荧光染料结合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一个试管，代替荧光的特异性单克隆抗体，其它步骤相同。

4）间接法对照：用10μl的PBS代替第一抗体。荧光第二抗体的浓度和使用量均与其它实验相同，其它实验步骤也和实验组相同。