1.蛋白A—金(PAg)复合物的制备(Slot 和Geuze,1981)

(1)胶体金液的制备,应用枸椽酸三钠还原法(见第五章 )。

(2)待标记蛋白质和金溶液的准备,同前。注意点是用0.2mol/l K2CO3将金溶液pH调至5.9~6.2之间。

(3)确定胶体金与蛋白A的结合用量比例。取一系列盛有0.1ml胶体金液的小玻璃管,分别加入不同量的蛋白A,5min后,再各加0.25ml 10%的NaCl。如加入的蛋白A浓度不够,不能稳住金粒,在电解质NaCl的影响下,金粒聚合沉淀,溶液由红变蓝。选择能防止溶液由红变蓝的最低浓度的蛋白A的量作为两者的结合比例。以枸椽酸钠法制成的胶体金每毫升约需要5μg蛋白A来结合,方能保证其稳定性。

(4)胶体金与蛋白A的结合和纯化,依上法测得所需的比例超过10%,即每30ml胶体中加入2mg蛋白A,5min后,加入0.3ml PEG作为稳定剂,然后以15000r/min离心45min(不同方法制备的金离心速度不同),略带红色的松散的复合物沉淀即为PAg复合物。小心弃去上清液,加入PBS冲洗,如上,松散的PAg复合物置于PBS溶液中,按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作为稳定剂,保存于硅化的玻璃器皿中备用,也有主张将上述PAg复合物放入3~6ml 5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%叠氮钠混合液中,再离心,弃去无色上清液后,收取管底部浓缩纯化的PAg复合物置4保存。

据文献报告,此PAg复合物的原液在4可保存达一年之久。