一、质粒或噬菌体载体与外源DNA的连接反应

外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体和外源DNA上限制酶切位点的性质决定了质粒或噬菌体与外源DNA连接反应的不同策略。

（一）外源DNA带有非互补突出端的片段

用两种不同的限制酶分别消化质粒等载体和外源DNA，可以产生带非互补突出端的片段，这是最容易连接的片段，如图24-1所示。

将已经连接外源DNA的细菌质粒载体转化感受态的大肠杆菌，然后在含有AP等抗生素的平板上鉴定阳性重组体菌落，具体方法有：①检查α互补能力的丧失情况；②对小量制备的质粒DNA进行限制酶切的分析；③核酸杂交。

（二）外源DNA带有相同末端（平端或粘端）的片段

带有相同末端（平端或粘端）的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线状质粒或噬菌体载体中，在连接反应中，质粒或噬菌体载体可能发生自身环化，也可能形成串联寡聚物。因而，常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制质粒DNA的自身连接和环化。用细菌碱性磷酸酶（BAP）或牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去除线状DNA两端的5’磷酸可以最大限度地减少质粒DNA的自身环化。而具有5’末端磷酸的外源DNA片段可有效地与去磷酸化质粒DNA相连接，产生一个含有两个切口的开环分子。因为环化DNA（即使只带切口的环状DNA）的转化效率比线状DNA高得多，所以大多数转化体都含有重组质粒，如图24-2所示。

利用磷酸酶防止载体DNA的重新环化

图24-2 利用磷酸酶防止载体DNA的重新环化

（三）外源DNA带有平端的片段

外源DNA片段带有平端的片段，平端的连接效率比带有互补末端的DNA要低得多。因此，涉及平端分子的连接反应所要求的T4噬菌体DNA连接酶的浓度和外源及质粒DNA或噬菌体DNA的浓度都要高得多。

（四）连接反应的体系

10×连接缓冲液1μl

10mMATp 1μl

质粒或噬菌体DNa200ng～1μg

外源DNa 200ng～1μg

T4噬菌DNA连接酶0.5～2nuits

4-6℃温育8～24h

连接反应结束时，取1～5μl上述反应混合物转化200μl的大肠杆菌感受态细胞，即可将外源DNA与载体接连起来。