四、ApoE基因型的检测

采用聚合酶链反应（PCR）限制性片段长度多态性（RFLP），即PCR-RFLP技术从基因水平检测ApoE基因多态性（基因型），操作简便、快速准确。

1．仪器与试剂

（1）仪器：电泳仪、基因扩增仪；

（2）试剂：Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA参考物（pBR322DNA/HacⅢmarkers）、HhaⅠ，其余试剂均为分析纯。

2．实验方法

（1）引物的设计与合成：引物参考文献设计，由Ranson Hill Bio Ssience Inc合成。序列为P1：5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’；P2：5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’。特异性扩增ApoE基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列（如图19-5）。产物片段292bp。

图19-5 PCR扩增产物经HhaⅠ酶切后RFLP模式

（2）模板DNA提取

①经典法，取全血100μl，蛋白酶K消化，按标准酚、氯仿、异戊醇法提取DNA；②碘化钠法，参照Loparev等法加以改良，取全血100μl加无菌双蒸水100μl混匀，加6mol/lNaⅠ200μl涡旋震荡30秒，加等体积氯仿/异戊醇（24：1），涡旋震荡30秒，离心后取上清加0.6体积异丙醇混匀，室温（或4℃）静置15min，离心后沉淀以37%异丙醇洗1次，晾干后溶于TE中。以上两法提取DNA经紫外分光光度计定量后，置-20℃保存备用；③微量血斑水煮法，取50μl全血点至无菌滤纸上，自然干燥后用甲醇固定，室温贮存。临用时，剪成一直径5mm的圆形血斑纸块，将其混至100μl无菌双蒸水中，100℃煮沸30min以裂解细胞。取混合物15μl作膜板用。

（3）PCR扩增；反应体系为50μl。其中含1×扩增缓冲液（Tris-HC167mmol,pH8.3；MgCl₂25mmol/L；KCl50mmol/L）5μl，1%二甲亚砜5μl，dNTP各200μmol/L（5μl），引物P1、P2各5μl（分别为0.5μmol/L，模板DNA200mg（5μl），双蒸水15μl，加石蜡油30μl，离心混匀，置热循环仪（PE2400型，Perkin Elmer Cetus）中95℃预变性12min后，再加入TaqDNA聚合酶2U（5μl），然后按下列程序循环35次，即94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1.5min,最后于72℃再延伸10min，取产物10μl经2%琼脂糖凝胶电泳（溴化乙啶），紫外灯下观察扩增为292bp。

（4）扩增产物的限制性酶切：PCR扩增产物17μl直接用10UHhaⅠ酶切，37℃消化4h。反应终止后产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色35min，以DNA片段长度标准物为参考，紫外灯下观察结果并照像。ApoE基因型判定参照Richard等方法加以简化，即ε2/2出现3条带（91bp,83bp,61bp），ε3/2出现5条带（91bp,83bp,61bp，48bp,35bp）,ε3/3出现4条带（91bp,61bp，48bp,35bp）,ε4/3出现5条带（91bp,83bp,61bp，48bp,35bp）,（91bp,72bp,61bp,48bp,35bp），ε4/2出现6条带（91bp,83bp,72bp,61bp，48bp,35bp）,ε4/4出现4条带（72bp,61bp,48bp,35bp）。

该法检测的ApoE基因型图谱如表19-2所示。表中所示动脉粥样硬化性脑梗死（ABI）。

表19-2 人ApoE基因型和等位基因频率分布（%）

*：P＜0.05；**P＜0.01(均与对照组比较)

病人ε4/3基因型频率（30.0%）与ε4等位基因频率(18.0%)均显著高于健康对照组。