二、血清低密度脂蛋白测定

LDL是一组不均一的脂蛋白颗粒,其胆固醇含量约占总胆固醇的45%~50%。

测定血浆中LDL,首先同样要分离LDL,其分离方法有超速离心法、聚阴离子沉淀法、色谱法、电泳法及计算法等。以聚阴离子沉淀法简便易于操作,结果准确可靠。由于直接测定LDL有一定的困难,因为它是蛋白质脂类组成的颗状结构,胆固醇是其较为衡定的因素,因此采用测定LDL中所含的胆固醇的浓度作为LDL定量的依据。

另外,还可以通过用Friedwal公式计算,主要是利用血清TC、TG及HDL-C浓度测定结果,即LDL-C=TC-HDL-C-(1/5)TG。对脂代谢异常的高脂血症,不能按此方法计算结果。

(一)聚乙烯硫酸盐(PVS)法

1.原理

生成的醌亚胺与上清液的TC含量成正比。

2.试剂组成

(1)沉淀剂:聚乙烯硫酸钾盐0.7g/L、聚乙二醇独甲醚170g/L、乙二胺四乙酸5mmol/L,混匀,4~21℃避光可保存一年。

(2)酶法胆固醇测定试剂(同第15章)。

(3)胆固醇标准液:2.58mmol/L。

3.操作

(1)空腹12h,采静脉血,3h内分离完成血清以免脂蛋白之间相互交换和防止LDL降解。-70℃可以保存数月之久。

(2)取200μl血清置于含有沉淀剂100μl试管中充分混匀,室温放置15min,3000r/min离心,留上清测定胆固醇。

(3)按下表进行操作:

空白管 测定管 标准管
上清液(μl) 30
定值血清(μl) 30
水(μl) 30
胆固醇酶试剂(μl) 2.0 2.0 2.0

混匀,37℃6min,以空白管调零(500nm),读取光密度。

(4)计算

血清LDL-C=TC-上清液胆固醇

(5)注意事项

标本沉淀过程严格按要求进行。吸取上清液时,注意轻吸,别搅动沉淀。

PVS法能将Lp(α)完全沉淀,一般情况下,正常人含量极少,一旦高脂血症、Lp(α)增高时,其测定值LDL-C应为LDL-C和Lp(α)-C之和。

(二)血清LDL-C直接测定法

1.原理

含反应活性剂的试剂Ⅰ加入血清后,与HDL、VLDL和CM反应,使其胆固醇水解并与酶反应生成无色产物溶于介质中。再加入含溶解LDL的活性剂Ⅱ试剂,使LDL水解并与其中的胆固醇试剂进行偶联反应生成红色化合物,定量血清中LDL-C。

以△A=A2-A1进行运算,测出LDL-C的含量

2.试剂(第一化学)

R1:去垢剂1、COD、POD、4-AAP。

R2:去垢剂2、DSBmT。

3.操作

按CL-7200型或其他型号全自动生化分析仪检测,有关参数如表16-2所示。

表16-2 LDL-C检测参数

名称 参数
分析方式 终点法
标本用量(μl) [3]
R1体积(μl) [300]
R2体积(μl) [100]
第一试剂时间 5min
第二试剂时间 5min
波长(nm) [560][600]

4.特点

(1)直接测定,无需预先处理。

(2)操作简便,减少影响准确性的因素。

(3)标本及试剂用量少,准确性高。

(4)抗干扰能力强,适合于自动化分析。

(5)该法CV为5%以下,回收率90%~110%,线性范围0~88mmol/L。

5.注意事项

待测血清标本于当日测试,2~8℃一周内保存,-20℃以下长期保存,结果均不受影响。