一、胶原的提取

动脉血管壁胶原提取的基本方法是,首先除去凝血等其他杂质,由于胶原为杆状三螺旋结构,能耐受胃蛋白酶的作用,但是两端球蛋白结构能被胃蛋白酶水解。胶原纤维内分子间的共价交联是由分子末端赖氨酸或羟赖氨酸形成,用胃蛋白酶切断末端交联结构,使胶原分子的巨形结构被破坏,从完整分子可提出各种类型的胶原。

(一)胶原的初步分离

1.小心取出动脉血管,用0.05mol/L BPS pH7.8洗净凝血块,3kr/min离心10min。

2.冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪,蒸馏水洗涤3次。

3.将组织破碎,加三倍体积组织匀浆处理液(0.5mol/L乙酸,pH2.5,1%胃蛋白酶)于4℃48h,16kr/min离心45min,同样方法重复3次。

4.向留取的上清液中缓缓加入NaCl,最终达到4mol/L浓度,搅拌12~24h,15kr/min离心45min,弃上清。

5.进一步分离各种胶原可用分段盐析和柱层析法进行操作。

(二)胶原的分段盐析

1.取初级提取物加0.1mmol/L乙酸,加NaCl至0.7mmol/L,15kr/min离心20min。沉淀提取Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原,上清提取Ⅳ、Ⅴ型胶原。

2.沉淀,加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保湿16h,10kr/min离心20min,上清液加NaCl至4mol/L,离心,沉淀物为Ⅳ型胶原。

3.1mol/L NaCl溶解沉淀,加3倍体积Tris-HCl pH7.4,10kr/min离心20min,沉淀为Ⅲ型胶原。

4.上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min离心20min,沉淀为Ⅰ胶原。

5.取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min离心20min。

6.沉淀溶于4倍体积1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4,加NaCl至4mol/L 10kr/min离心20min。

7.上清加NaCl至4mol/L,调pH到3.5,离心得沉淀再加5倍体积0.2mol/l NaCl、1mol/L脲、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液悬浮16h,小心取上清加NaCl至4mol/L,10kr/min离心10min,沉淀为Ⅳ型胶原。

8.将6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE悬浮16h,上清加NaCl至4mol/l,10kr/min离心10min,沉淀为Ⅴ型胶原。

(三)将初步提取的胶原加到DEAE纤维柱上,用0.2mmol/l NaCl、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脱,230nm波长检测洗脱物。因为胶原在pH7.5时均带正电荷,不与DEAE柱结合,所以被柱结合的则为非胶原蛋白。