幽门螺杆菌的生物学特性的研究(当前章节内容组合)

1 材料和方法

1.1 材料 各型胃病患者共200例。年龄19岁～80岁，平均46.9岁。男222例，女78例。患者经胃镜检查时，均在胃窦部或求部钳取粘膜组织两块，置于含10%灭活小牛血清的布氏肉汤中放于4°C冰箱中保存，送检。

1.2 方法

1.2.1 尿素试验 参考Christtensen尿素肉汤培养和mlorris等快速诊断法,先用2%液体尿素常规法,后用10%液体尿素1min检查法及5%尿素滤纸片法,进行了对比研究。

1.2.2 直接涂片镜检 用保存液将胃粘膜研磨成匀浆后，取一滴推成涂片，甲醇固定后用0.3%碱性复红单染，于显微镜下直接检查。

1.2.3 幽门螺杆菌培养 以布氏琼脂培养基为基础，加入6%脱纤维新鲜羊血及联合抗生素（TmP5mg/L、万古霉素6mg/L、两性霉素2mg/L），制成血平皿，放置4°C冰箱中保存、备用。从送检的Hp保存液中用白金耳取出胃粘膜组织块放入玻璃研磨器中，加入0.5ml保存液，研磨成匀浆，用1ml吸管吸取0.2ml于血平皿中涂匀，将平皿置于10%CO2，5%O2及85%N2混合气体培养箱中，37°C培养72h后观察培养结果。剩下 液体匀浆于尿素酶快诊及直接涂片镜检。

1.2.4 药敏试验 抗菌药物敏感试验所用试纸系参考WHO建议的药敏试验质量控制标准及国内外有关资料制备而成，由大连生物试剂厂生产，专供用纸片扩散法来检测细菌对抗菌药物的敏感度。试验中所用菌液为用0.1%胨生理盐水洗下的37°C48h培养物，浓度为2×109cfu/ml。用1ml吸管取0.1ml菌液于血平皿上，涂匀，之后将药敏片按适当的间距平贴于平皿上，一般9m直径的平皿上贴6张药敏片。最后将平皿置于混合气体培养箱中37°C培养48～72h，观察试验结果，测量抑菌环直径。

1.2.5 杀螺杆菌抗体检测 原理：氧化酶反应阳性的细菌，由于氧化酶的作用，可使TTC用灭菌蒸馏水配成0.5%的溶液；指示菌用Hp295 37°C48h的培养物，其浓度为107cfu/ml；补体一指示菌悬液的制备：补体取4只豚鼠的新鲜分离血清，用生理盐水作1:20稀释，再加入最终浓度为1%（V/V）的指示菌，即为浓度相当于105cfu/ml的补体—指示菌悬液；微量定量板用4×10孔板。方法：①每孔先加入0.1ml生理盐水。②第一孔加入1:5被检灭活血清（取自胃病患者）0.1ml，之后顺序作从1:10～1:5120的对倍稀释。③每孔加补体—指示菌悬浮液一滴，约0.05ml。④最后每孔加入含0.01%TTC布氏肉汤0.1ml（0.5%TTC用布氏肉汤作50倍释稀。混合后盖上塑料盖，于37°C培养20～24h后观察结果。以无红色出现的孔内的血清稀释度作为被检血清的杀螺杆菌抗体的最高滴度。

1.2.6 动物试验 实验选用小鼠C57、BALb/c和金黄色地鼠（由本所动物室提供）用布氏肉汤将新培养的Hp菌洗下，浓度大约配成2×109cfu/ml，每只小鼠一次灌胃约0.5～1ml菌液，每周2次，共4次～6次，末次灌胃后3～7d，处死动物，解剖后取两块胃粘膜组织作尿素酶快诊和Hp菌培养及组织切片。

1.2.7 统计学方法 统计学方法采用X2检验。

2 结果

2.1 尿素酶快速诊断 Hp能产生大量的尿素酶，分解尿素产生氨，使pH值升高，据此将尿素酶液全培养基颜色由桔黄色变为粉红色的反应定为阳性反应。试验结果如表1所示：

表 1 不同时间尿素酶快诊结果

从表中看出，4h和24h尿素酶快诊的阳性率分别为55%和62%。在300份胃病患者的胃粘膜Hp培养中，有195例为阳性。阳性率为65%，与4h尿素酶快诊阳性率之间无显著性差异，（P＞0.05）。尿素酶快诊阳性结果与Hp培养阳性结果之间的对应关系良好，培养出的195例Hp菌株作尿素酶快诊，在1min内均呈阳性反应，特异性达100%。而4h和24h尿素酶快诊的敏感性分别为84.6%(165/195)。因此用尿素酶作Hp快诊，在早期及Hp培养后进行，均有其非常特异而重要的意义。

2.2 直接涂片镜检 对其中21例作了直接涂片镜检，结果有4例镜下可见成簇Hp（+++）占19.0%；有1例镜下易找到Hp（++），占4.8%；有9例镜下可见Hp零星存在（+），占42.9%；6例镜检为阴性。镜检阳性率为66.7%。21例Hp 培养阳性为16份，阳性率为76.2%，与镜检阳性率之间无显著差异（P＞0.05）。镜检阳性符合率为87.5%(14/16)。

2.3 Hp的运送、培养及生化反应

2.3.1 运送Hp生长的营养条件很高，而从采样到分离培养需要一段时间，送检中保存问题当然重要，有文献报道将胃粘膜标本浸在20%葡萄糖液体内送检，5h之内不会影响阳性率。为了探索一条保存时间长、效果好的方法，我们试用含10%小牛血清的布氏肉汤作标本保存液，4°C冰箱保存，用冰壶送检，随机对300例胃粘膜标本进行了不同时间的分离培养，所用平皿是新配制或在密闭条件下保存备用的，增养结果是保存1～8h的标本阳性率为47.5%～78.6%，有1例标本不保存液中存放了17d后Hp培养仍阳性。

2.3.2 培养300例胃粘膜标本，培养Hp结果有195份阳性，阳性率为65.0%。菌落形态：37°C微氧条件下培养72h后，可见0.5～1mm直径大小、圆形、扁平、湿润、半透明的灰白色菌落，偶尔可见菌落周围有β微溶血现象。菌体形态：显微镜下菌体呈弧型、S型或海鸥展翅状，与空肠弯曲菌相类似。72h镜检菌体呈弧形或弯曲状，比空肠弯曲菌要大，着色较好。五日以上菌体呈多形状，有直杆形、微弯曲型或球形，着色不均匀。

2.3.3 生化反应 Hp的氧化酶、过氧化酶、尿素酶均为阳性反应。其中尿素酶反应的时间与细菌浓度成反比。葡萄糖发酵、硝酸盐还原、及3.5%NaCl反应均为阴性。马尿酸水解反应84.1%为阴性，15.9%为弱阳性。1%甘氨酸反应87.0%为阳性。0.04%2、3、5TTC反应8.6%为阳性。

2.4 药敏试验 选取22株生长良好的Hp菌作药敏试验,结果如表2所示.从表中可以看出：Hp对链霉素、四环素、氯霉素、先锋霉素、利福平、卡那霉素、红霉素、新霉素及大霉素较为敏感。而对复方新诺明、萘啶酮酸和多粘菌素B有耐受作用。另外，选用8株Hp对中医研究院研制的五种中药即Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ号及胃丹C进行了药敏试验，结果表明作用减弱，抑菌环直径分别为16～20mm，20mm，10～20mm，0mm及10～14mm。

表2 22株Hp的药敏试验结果

注：( )内敏感百分比

2.5 杀菌杆菌抗体 对40份受检胃病患者的血清进行了杀Hp抗体的检测试验，结果见表3。根据诊断标准 ，杀Hp抗体滴度≥1:160时为阳性，则杀Hp抗体检测试验的实际阳性率为57.5%。对应40份患者胃粘膜标本Hp培养阳性者为29份，阳性率为72.5%，与杀Hp抗体试验的阳性率之间无显著性差异（P＞0.05）。

2.6 动物试验结果 ①尿素酶快诊仅BALb/c小鼠呈阳性反应，其他小鼠均为阴性。而正常BALb/c小鼠胃粘膜的尿素酶快诊也偶尔呈阳性反应，因此推测尿素酶阳性者不一定是Hp感染，由何引起有待进一步研究。②Hp培养均为阴性。③尿素本科阳性的BALb/c小鼠的胃粘膜病理组织切片检查，可见粘膜上皮中有嗜酸性染色的杆菌存在，在大量白细胞，偶尔可见形态类似螺杆菌的细菌的存在。

表3 杀幽门螺杆菌抗体试验结果

3 讨论

幽门螺杆菌所含脂肪酸种类含量与其它弯曲菌及肠道菌不同。在DNA杂交试验中，其DNA与螺旋菌或弧菌不相溶，而只与螺杆菌的DNA相容。此菌可使人罹患慢性活动性胃炎。电镜观察该菌表面粗糙，且具有许多单孔有鞘的鞭毛，且鞭毛鞘细胞壁外膜相连。Hp菌形为弧形、D型或海鸥展翅状，革兰染色阴性，碱性复红单染效果较好。尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶反应性阳性。微氧条件下生长，在血平皿上及含10%小牛血清的布氏肉汤中生长良好。195份Hp培养阳性的胃粘膜标本中，4h尿素酶快诊的阳性检出率为84.6%，特异性为100%。直接涂片镜检能查出较为典型的Hp菌，阳性检出率为87.5%。因此，这两种方法对于Hp菌的快诊都具有重要的意义。为了配合临床的诊断粘膜标本应尽快送检。但如送检条件受限，标本可保存在含10%小牛血清的布氏肉汤液体保护中。在4°C冰箱中，Hp一般可存活1W左右，最长者可存活17d。更好的保护液有待进一步研究。由于Hp的存活、传代保存问题尚未解决，致使各实验室出现不尽一致的结果，所以需要有一个适合于Hp菌生长的统一的阳性对照，如培养基中加入血清、活性炭、玉米淀粉、猪胃粘蛋白、甲基纤维素的mlueller-hinton琼脂、布氏琼脂、胰酶消化大豆琼脂等等，以适合于Hp生长、吸收或抑制毒性因子。

目前，国内外对Hp的研究尚处初期阶段，多数学者认为Hp与慢性活动性胃炎和消化性溃疡有关，用敏感的抗生素及TDB治疗，随着病变的恢复，Hp消失，溃疡的复发率也随之降低。除应用一些敏感的抗生素之外，中草药的研究、治疗也不可忽视。

对Hp动物实验的研究，国外报道用无菌动物及悉生动物（SPF），主要有幼年小猪、水獭、雪貂及恒河猴等。国内探索用大白鼠研究胃炎及溃疡的动物模型，观察Hp感染组与非感染组的不同药物疗效。我们实验室用不同种的小白鼠进行Hp感染，没能形成明显的病理改变，推测其原因可能是受试动物对Hp不敏感而形成自身保护，Hp菌不能长期滞留胃内，对胃粘膜不能构成威胁。因此，为了研究Hp的毒力，致病性，为了研制一种疗效高、副作用小的中、西药物，一种适宜的动物模型是非常重要的。