按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。
表20-1 DNA重组技术中最常用的工具酶
| 酶 | 主要用途 |
| 限制性核酸内切酶 | 识别DNA特定序列，切断DNA链 |
| DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow） | ①缺口平移制作标记DNA探针 ②合成cDNA的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA序列分析 |
| 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） | 聚合酶链反应（PCR） |
| DNA连接酶 | 连接两个DNA分子或片段 |
| 多核苷酸激酶 | 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 |
| 末端转移酶 | 在3’末端加入同质多聚物尾 |
| SI核酸酶，绿豆核酸酶 | 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 |
| DNA端酶Ⅰ | 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 |
| RNA酶A | 降解除RNA |
| 磷酸酶 | 切除核酸末端磷酸基 |
