首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成△4-胆甾烯酮和H2O2，再H2O2经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。
H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素
（一）手工测定法
1．试剂组成
| 代号 | 种类 | 浓度 | 组成 | 贮2～8℃ | 有效时间 |
| Na2HPO4 | 50mmol/L | ||||
| Na2H2PO4 | 50mmol/L | ||||
| 胆酸钠 | 3mmol/L | ||||
| 4-氨基安替比林 | 0.82mmol/L | ||||
| R1* | ESPAS | 14mmol/L | 24h | ||
| Carbowax-6000 | 0.17mmol/L | ||||
| CEH | 33U/L | ||||
| COD | 117U/L | ||||
| POD | 6700U/L | ||||
| R2 | 标准液 | 5.17mmol/L | 用异丙醇溶解胆固醇 |
*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。
2．操作
按图15-2操作。
3．计算
标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)
（二）自动化分析仪测定
以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。
1．试剂组成
A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。
B液：COD、4-氨基安替比林等。
图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图
2．上机参数
| 项 目 | 参 数 |
| 方 法 | 终点法 |
| 波 长 | 双波长（540nm，700nm） |
| 反应温度 | 37℃ |
| 试剂A反应时间 | 2～3min |
| 试剂B反应时间 | 5～6min |
| 样本用量 | 3μl |
| 试剂A用量 | 250μl |
| 试剂B用量 | 120μl |
| 单位 | mmol/L |
3．操作过程
4．计算
以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。
5．注意事项
（1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。
（2）试剂在有效内2～8℃避光食保存。
（3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。
