《动脉粥样硬化》(全本)

第一章　脂质化学及其代谢

第一节　脂质种类及化学结构（缺）

第二节　脂质代谢

一、脂肪酸代谢

（一）脂肪酸（fattycaid）的分解代谢-脂肪动员

动物将脂肪酸以甘油三酯的形式贮存在脂肪组织内。一旦机体需要时，脂肪酶即可逐步水解甘油三酯为游离脂肪酸（freefat acid, FFA）及甘油并释放入血以供其他组织氧化利用，这一过程称为脂肪动员。调节这一过程的关键酶为激素敏感性甘油三酯脂肪酶。当禁食、饥饿或交感神经兴奋时，肾上腺素、去甲肾上腺素、胰高血糖素等分泌增加，作用于脂肪细胞膜表面受体，激活腺苷酸环化酶，促进cAMP合成，激活cAMP-蛋白激酶，使胞液内甘油三酯脂及的调控敏感，故称为激素敏感性脂肪酶。

脂肪分解成游离脂肪酸和甘油后进入血。血浆白蛋白具有结合游离脂肪酸的能力，脂肪酸不溶于水，与白蛋白结合后由血流运送至全身各组织，主要由心、肝、骨骼肌等摄取利用。甘油溶于水，直接由血液运送至肝、肾、肠等组织。在肝甘油激酶（glycerokinase）作用下，转变为α-磷酸甘油，然后脱氢生成磷酸二羟丙酮，循糖代谢径而代谢。

（二）脂肪酸的β-氧化

脂肪酸是人及哺乳动物的主要能源物质。供能方式是通过β-氧化，在O₂供给充足的条件下，脂肪酸在体内被分解成CO₂和H₂O并释放出大量能量以ATP形式供机体利用。除脑组织外，大多数组织均能氧化脂肪酸，但以肝和肌肉最为活跃。脂肪酸氧化的亚细胞器是线粒体，而脂肪酸是不能自由通过其内膜的。因此脂肪酸在进入线粒体之前必然被活化和转载。

1．脂肪酸的活化-脂酰CoA的生成。

在ATP、CoASH、Mg²⁺存在下，脂酰CoA合成酶（acyl-CoAsynthetase）催化脂肪酸活化，生成脂酰CoA。

2.脂酰CoA进入线粒体

在线粒体内膜两侧有肉毒碱脂酰转移酶(carnitine acyltransferase)Ⅰ和Ⅱ,该酶促进脂酰CoA将脂酰基转移到肉毒碱生成脂酰肉毒碱.后者与载体结合进入线粒体内侧,在内侧由肉毒碱脂酰转移酶Ⅱ催化脂酰肉毒碱转变为脂酰CoA并释放肉毒碱。

3．脂肪酸的β-氧化

在线粒体基质中疏松结合的脂肪酸β-氧化多酶复合体的催化下，从酯酰基的β-碳原子开始进行脱氢，加水，再脱氢及硫解等四步连续反应，脂酰基断裂生成-分子比原来少两个碳原子的脂酰CoA和-分子乙酰CoA。

4．脂肪酸氧化的能量生成

体内能量的重要来源之一是脂肪酸的氧化。以软脂酸为例，进行7次β-氧化，生成7分子FADH₂，7分子NADH+H⁺及8分子酰CoA。每分子FADH₂通过呼吸链氧化产生2分子ATP，每分子ANDH+H⁺氧化产生3分子ATP，每分子乙酰CoA通过三羧酸循环氧化产生12分子ATP。因此一分子软脂肪酸彻底氧化共生成（7×2）+（7×3）+（8×12）=131ATP。减去脂酸活化时耗去的2个高能磷酸键，相当于2个，ATP净生成129分子ATP或129×30.5=3935KJ/mol。软脂酸在体外彻底氧化成CO₂及H₂O时的自由能为971KJ。故其能量利用率为：

3935/9791×100%=40%

5．脂肪酸的其他氧化方式

除β-氧化之外，机体还存在脂肪酸氧化的其他方式：①不饱和脂肪酸的氧化。不饱和脂肪酸也在线粒体中进行β-氧化，所不同的是饱和脂肪素β-氧化过程中产生的脂肪烯酰CoA是反式△²脂烯酰CoA，而天然不饱和脂肪酸中的双键均为顺式。因此，需经线粒体特异的△³顺→△²反脂烯酰CoA异构酶的催化，将△³顺式转变为β-氧化酶系所需的△²反式构型，然后沿β-氧化途径进行代谢。②过氧化酶体脂肪酸氧化，除线粒体外，过氧化酶体中亦存在脂肪酸β-氧化酶系，它能使极长链脂肪酸氧化成较短链脂肪酸，而对较短链脂肪酸无效；在脂肪酸氧化酶（FAD为辅基）催化下，脱下的氢不与呼吸链偶联产生ATP而是生成H₂O₂，后者为过氧化氢酶分解；③丙酸的氧化，人体含有极少量奇数碳原子脂肪酸，β-氧化后除生成乙酰CoA外，最终生成丙酰CoA。另外，支链氨基酸氧化亦可产生丙酰CoA。丙酰CoA经β-羧化及异构酶的作用可转变为琥珀酰CoA，然后参加三羧酸循环而被氧化。

6．酮体的生成及利用

酮体是乙酰乙酸（acetoacetate），β-羟丁酸（β-hydroxybatyrate）及丙酮（acetone）三者的统称。酮体是脂肪酸在肝分解氧化时特有的中间代谢物，因为只有肝具有合成酮体的酶系，但缺乏利用酮体的酶系。

酮体的利用，除肝外，肝外心、肾、脑及骨骼肌线粒体是较高活性的利用酶。其一是琥珀酰CoA转硫酶，催化乙酸转变为乙酰乙酰CoA，其二是乙酰乙酰CoA硫解酶催化乙酰乙酰CoA生成乙酰CoA，后者即可进入三羧酸循环而被氧化供能。其三是乙酰乙酸硫激酶，此酶可直接活化乙酰乙酸生成乙酰乙酰CoA，后者在硫解酶的作用下硫解为2分子乙酰CoA。

另外，β-羟基丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的催化下，脱氢生成乙酰乙酸，然后循上述途径代谢。而丙酮不能按上述方式活化，除随尿排出外，在血中酮体剧烈升高时，可从肺直接呼出，总之，肝是生成酮体的器官，但不能利用酮体，而肝外组织不能生成酮体，却可利用酮体。

（三）脂肪酸的合成代谢

长链脂肪酸以乙酰CoA为原料在胞液内由不同于β-氧化的脂肪酸合成酶及多功能酶等催化而完成。

1．脂肪酸合成酶系及反应过程

在乙酸CoA羟化酶的作用下，乙酰CoA羧化成丙二酸单酰CoA。

ATP+HCO^3-+乙酰CoA→丙二酰CoA+ADP+Pi

在多酶体系或多功能酶的作用下，乙酰CoA与丙乙酰开始重复加成过程，每次延长二个碳原子。十六碳软酯酸的生成，需经过连续的七步重复加成。

脂肪酸生物合成，从乙酰CoA合成丁酰-S-ACP为第一轮反应，七步反应分别有七种酶催化。①乙酰CoA羧化酶；②乙酰基-ACP转移酶；③丙二酸单酰基-ACP转移酶；④3-酮酰基-合成酶；⑤3-酮酰基-ACP还原酶；⑥3-羧酰基-ACP脱水酶；⑦3-烯酰基-ACP还原酶。七种酶催化完成七步反应最后生成丁酰-SACP。需指出的是在大肠杆菌中七种酶蛋白聚合在一起构成多酶体系，而高等动物，这七种酶活性都在一条多肽链上，属多功能酶。

脂肪酸生物合成的碳链延伸循环过程是每轮新生成的酰基-SACP再与丙二酸单酰-SACP缩合，经还原、脱水和还原诸反应延伸两个碳原子，这样每轮循环，加上两个碳原子。所以软脂酸经七次循环即生成。

2，不饱和脂肪酸的合成

人体所含的不饱和脂肪酸主要有软油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等。前两种可由人体自身合成，而后三种则必须从食物摄取，因为人体缺乏相应的去饱和酶。

去饱和酶位于动物体内组织内质网上，其催化脱氢过程已基本明了。此氧化脱氢过程有线粒体外电子传递系统参与。该系统在有机毒物氧化或苯环上加氧等机体解毒过程中，也有重要作用。例如去饱和酶能使硬脂酸（18：0）脱去2H成油酸（18：1，△⁹）。

3．脂肪酸合成的调节

脂肪酸合成主要受二方面的调节：一是代谢物的调节作用。进食高脂肪食物以后或饥饿会使脂肪动员加强，肝细胞内脂酰CoA增多，可别构抑制乙酰CoA羧化酶，从而抑制体内脂肪酸的合成；进食糖类使糖代谢加强。NADPH及乙酰CoA供应增多，有利于脂肪酸的合成，同时糖代谢加强使细胞内ATP增多，可抑制异柠檬酸脱氢酶，造成异柠檬酸及柠檬酸堆积，透出线粒体，可别构激活乙酰CoA羧化酶，使脂肪酸合成增加，此外，大量进食糖类也能增加各种合成脂肪有关的酶活性从而使脂肪合成增强；二是激素的调节作用。胰岛素是调节脂肪合成的主要激素，它能诱导乙酶羟化酶，脂肪酸合成酶乃至ATP-柠檬酸裂解酶等的合成，从而促进脂肪酸合成。胰岛素还能促进脂肪酸合成磷脂酸。胰高血糖素，肾上腺素、生长素则与胰岛素作用相反，通过抑制乙酰CoA羧化酶的活性，从而阻止脂肪酸的合成。

二、多不饱和脂肪酸的重要衍生物-前列腺素、血栓烷及白三烯

前列腺素（prostglandins,PG）最早发现于精液，现知前列激腺素来源广泛，种类繁多，但均为二十碳多不饱和脂肪酸的衍生物。血栓烷（thromboxane,TX）来自白细胞，是由二十碳多不饱和脂肪酸的衍生物，来自血小板。白三烯（leukotrienes，LT）来自白细胞，是由二十碳多不饱和和脂肪酸衍生而来。PG、TXA₂及LT₃几乎参予了所有细胞代谢活动，并且与炎症、免疫、过敏、心血管病等重要病理过程有关，在调节细胞代谢上亦具有重要作用。

（一）前列腺素（PG）、血栓烷（TX）及白三烯（LT）的合成

1．PG及TX的合成。

以花生四烯酸为原料，机体除红细胞外，其他各组织均有合成PG的酶系。血小板内还有血栓烷合成酶。当细胞受外界剌激如血管紧张素Ⅱ（agniotensionⅡ）、缓激肽（bradydinin）、肾上腺素、凝血酶及某些抗原抗体复合物或一些病理因子（许多激活因素尚未清楚），细胞膜中磷脂酶被激活，使磷脂水解释出花生四烯酸，在一系列的作用下，逐步合成PG和TX，其合成过程如图1-1所示。

图1-1 PG和TX合成示意图

2．白三烯的合成

白三烯合成同样以花生四烯酸为原料，在脂氧合酶（lipoxygenase）作用下，生成氢过氧化二十四烯酸（5-HPETE），后者在脱水酶作用下生成白三烯（LTA₄）。LTA₄在酶促作用下转变成具有重要生物活性的化合物，如LTB₄、LTC₄、LTD₄、及LTE₄等。如图1-2所示。

（二）血栓烷（TX），内过氧化物与环前列腺素（PGI2）

这两种物质是与前列腺素有密切联系的化合物。血栓烷A₂（TXA₂）由血小板内血栓烷合成酶催化合成。由于是首先在血小板内分离出而且分子内含有一个血栓烷，故名。血栓烷B₂（TXB₂）和6-酮基前列腺素F_1a是TXA₂和PGI₂的降解产物，无生物活性。环前列腺素（PGI₂）含有二个五碳环。故名，它是在人类动脉及静脉最里面的内衬处合成（包括冠状动脉内衬），由环前列腺素合成酶催化。

图1-2 白三烯合成示意图

三、胆固醇代谢

（一）胆固醇（clolesterol）的消化吸收

胆固醇主要由机体自身合成，但亦从食物中少量摄取。胆固醇主要来自动物内脏、蛋黄、奶油、肉等动物性食品，植物性食品不含胆固醇，但含植物固醇，过多摄入植物固醇可抑制胆固醇的吸收。食物中胆固醇以游离胆固醇和胆固醇酯两种形式存在，其中游离胆固醇占总量的85%～90%。胆固醇酯经胆汁酸盐乳化后，在小肠中为胰胆固醇酯酶水解生成游离胆固醇。游离胆固醇与胆汁酸盐，磷脂及脂肪的水解产物甘油一酯、脂酸等结合成混合微团，为小肠粘膜吸收。吸收的游离胆固醇80%～90%在肠粘膜细胞内，又与长链脂酸（主要是油酸）结合成胆固醇酯，后者大部分参入乳糜微粒（chylomicrons,CM），少量参与组成极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein, VLDL）经淋巴进入血循环。未被吸收的胆固醇在小肠下段及结肠被细菌还原转化为类固醇随粪便排出。

胆固醇的消化吸收可以由以下因素影响：①胆汁酸盐，它促进脂类包括胆固醇及固醇酯的乳化，既有利于胰脂酶及胆固醇酯酶及胆固醇酯酶的作用，又有利于胆固醇的吸收；②食物脂肪，脂肪能促进胆汁分泌，其分解产物又是混合微团的重要成份，它还促进肠粘膜细胞合成乳糜微粒，故食物脂肪有利于胆固醇的吸收；③植物固醇，由于其结构与胆固醇相似，但不易吸收，摄入过多可抑制胆固醇的吸收；④纤维素、果酸可与胆汁酯盐结合而促进其粪便排出，间接减少胆固醇的吸收；⑤某些药物如消胆胺，系阴离子交换树脂，它可与胆汁酸盐结合，加速胆汁酸盐的排泄，间接减少胆固醇的吸收。

（二）胆固醇的合成

1．合成部位

胆固醇合成部位除成年动物脑组织及成熟红细胞外，几乎在全身各组织内都可合成。但肝是主要合成场所，占合成总量的70%～80%。胆固醇合成酶系存在于胞液及光面内质网膜上，因此胆固醇的合成主要在胞液及内质网中进行。

2．合成过程

胆固醇合成部位以乙酰CoA为原料，而乙酰CoA主要产生于线粒体内，它不能自由通过线粒体内膜，需在线粒体内先与草酰乙酸缩合成柠檬酸，后者再通过线粒体内膜的载体进入胞液，然后在柠檬酸裂解酶的作用下，裂解生成乙酰CoA。这一过程是耗能的，每转支1分子乙酰CoA，要耗去1分子ATP。由乙酰CoA合成胆固醇需要大量的NADPH+H⁺及ATP供给合成反应所需的氢和能量。每合成1分子胆固醇需18分子乙酰CoA，36分子ATP及16分子NADPH+H⁺。乙酰CoA及ATP大多来自线粒体中糖的有氧氢化，而NADPH则主要来自胞液中糖的磷酸戊糖代谢途径。胆固醇合成步骤十分复杂，有近30步酶促反应大致可划分为三个阶段：

（1）甲羟戊酸的合成。在乙酰乙酰硫解酶的催化下，二分子乙酰CoA缩合成乙酰乙酰CoA；然后在羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶（3-hydroxy-3-methylglutarylCoASynthase,HMG CoA Synthase）的催化下再与一分子乙酰CoA缩合生成痉甲基戊二酸单酰CoA（3-hydroxy-3methylglutarylCoA,HMGCoA）。HMGCoA是合成胆固醇及酮体的重要中间产物。在线粒体中，三分子乙酰CoA缩合成的HMGCoA裂解后生成酮体；而在胞液中生成的HMGCoA则在内质网HMGCoA还原酶（HMGCoA reductase ）的催化下，由NADPH+H⁺供氢，还原生成甲痉戊酸（mevalonicacid,MVA）。HMG CoA还原酶是合成胆固醇的限速酶，该步也是胆固醇合成的限速反应。

(2)鲨烯的合成。MVA（C₆）由ATP提供能量，在胞液内一系列酶的催化下，脱羧、磷酸化生成活泼的异戊烯焦磷酸（△³-isopenterylpyrophosphate, IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（3,3-dimetytlallypyrophosphate ,DPP）然后三分子活泼的5C焦磷酸化合物（IPP及DPP）缩合成15C的焦磷酸法呢酯(farnesylpyrophosfhate, EPP)。二分子15C焦磷酸法呢酯在内质网鲨烯合酶(squalenesynthase)的作用下，再缩合，还原即生成30C的多烯烃-鲨烯(squalene)。

图1-3 胆固醇合成代谢图

（3）胆固醇的合成。鲨烯为含30个碳原子的多烯烃，具有与固醇母相近似的结构。鲨烯结合在胞液中固醇载体蛋白（sterolcarrierprotein,SCP）上以内质网单加氧酶和环化酶等的作用，环化生成羊毛固醇，后者再烃经氧化，脱羧，还原等反应，脱云个甲基（次CO₂形式后成27℃的胆固醇，如图1-3所示。

3.合成调节

对胆固醇合成的调节主要是通过对HMGCoA还原酶活性的影响来实现的。

（１）饥饿与饱食。饥饿与禁食可抑制肝合成胆固醇。禁食使HMGCoA还原酶合成减少活性降低外，乙酰CoA，ATP，NADPH+H⁺的不足也是胆固醇合成减少的重要原因。相反摄取高糖、高饱和脂肪膳食后，肝HMGCoA还原酶活性增加，胆固醇的合成增加。

（2）胆固醇。它可反馈抑制肝胆固醇合成，主要是HMGCoA还原酶的合成。如图1-3所示。

（3）激素。胰岛素及甲状腺素能诱导肝HMGCoA还原酶的合成，从而加速胆固醇的合成。胰高血糖素及皮质醇则能抑制则能抑制并降低HMGCoA还原酶的活性，因而减少胆固醇的合成。甲状腺素除能促进HMGCoA还原酶的合成外，同时又促进胆固醇在肝转变为胆汁酸，且后一作用较前者强，结果使血清胆固醇含量反而下降。

另外，胆固醇合成有明显的昼夜节律性。午夜时合成最高，而中午合成最低，主要是肝HMGCoA还原酶活性有昼夜节律性所致。

（三）胆固醇的转化

1．在肝内转化成肝汁酸

正常人每天约合成1.0-1.5g胆固醇，其中约2/5（0.4-0.6g）在肝内转变成胆汁酸，随胆汁排入肠道。胆固醇在肝实质细胞的内质网7α羟化酶作用下，由NADPH+H⁺供氢，O₂参加，7α-羟化生成7α-羟胆固醇。7α-羟化酶属单加氧酶系，是胆汁酸合成的限速酶。7α-羟胆固醇在内质网3α-及12α-羟化酶的作用下，亦需NADPH+H⁺及O₂参加，3α-及12α-羟化，然后17β侧链经β-氧化脱去丙酰CoA即形成24C的胆酸。仅3α和7α-羟则生成鹅脱氧胆酸。二者再在肝细胞酶的催化下，分别与甘氨酸及牛磺酸结合即形成结合型的甘氨胆酸，牛磺胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸及牛磺鹅脱氧胆酸。结合型的胆汁酸分泌入毛细胆管经胆管随胆汁排入胆囊储存或排入肠道。胆汁酸可反馈抑制7α-羟化酶从而抑制胆汁酸的合成。结合型的初级胆汁酸随胆汁分泌入肠道后，在小肠下段及大肠中受细菌的作用，发生水解，生成游离型的胆汁酸随胆汁分泌入肠道细菌作用下，使7α羟基脱氧，胆酸转变为7-脱氧胆酸（7-deoxycholic acid）鹅脱氧胆酸转变为石胆酸（ lithocholic acid）。在肠道细菌作用后生成的7-脱氧胆酸及石胆酸即次级胆汁酸。

胆汁酸排入肠腔后，大部分未经细菌作用的结合型胆汁酸（甘氨胆酸及牛磺胆酸）在小肠，主要是回肠，通过主动吸收经门静脉回到肝，经肠道细胞作用后的游离型次级胆汁酸在大肠通过被动扩散进入门静脉。然后进入肝。肝细胞将从肠道来的游离型次级胆汁酸转变为结合型初级胆汁酸，与新合成的结合型胆汁酸一起，再分泌入毛细血管，经胆道又排入肠腔，这一过程称为肠肝循环。每次由肝排入肠腔的胆汁酸95%以上均被重吸收再利用，仅小部分随粪便排出。

胆汁酸生理作用是促进脂类的消化吸收。由于胆汁酸分子具有亲水和疏水的两个侧面，是一种很好的乳化剂，能使疏水的酯类在水中乳化成细小的微团，既有利于消化酶的作用，又促进其吸收。另外，还可阻止胆固醇在胆汁中形成结石（沉淀）。胆固醇难溶于水，胆汁在胆囊中浓缩后胆固醇较易析出沉淀。而胆汁酸盐卵磷酯，可使胆固醇分散形成成可溶性微团，使之不易形成结晶。若胆汁中胆固醇浓度过高或胆汁中酸盐及卵类脂与胆固醇的比值降低（小于10：1），则胆固醇析出沉淀，引起结石。

2．胆固醇在肝外组织的转化

胆固醇是肾上腺皮质、睾丸、卵巢等内分泌腺合成类固醇激素的原料。合成类固醇激素是胆固醇在体内代谢的重要途径。

（1）肾上腺皮质激素的合成。肾上腺皮质的球状带、束状带及网状带分别能够合成醛固酮、皮质醇（酮）、性激素。胆固醇是合成这些激素的原料。胆固醇在皮质细胞线粒体内膜的20α-羟化酶，22β-羟化酶及20，22碳链裂解酶的作用下，断裂侧链、释出一分子异已醛（6C），生成21碳的孕烯醇酮，羟化反应需NADPH+H⁺及O₂参加。然后孕烯醇酮输出线粒体，在内质网异构酶的催化下，脱氢异构化生成21的碳的孕酮。孕酮是合成皮质激素的重要中间物，本身也具有激素活性，孕酮在17α、21β、11β及18羟化后，即可合成不同的皮质激素。

（2）睾丸酮的合成。睾丸间质细胞可直接以血胆固醇为原料合成睾丸酮。在17α-羟化酶及17，20碳裂解酸的作用下，胆固醇转化睾丸酮。

（3）雌性激素的合成。睾丸酮是卵巢合成雌二醇的直接前体。卵巢独有19-羟化酶，19-氧化酶及10,19碳裂解酶,在NADPH+H⁺及O₂的参加下,睾丸酮的19位甲基氧化,三环芳香化转变为苯环,形成雌二醇。雌二醇的生理活性最大，雌酮（estrone）及雌三醇（estriol）为其代谢产物。

图1-4 胆固醇的主要代谢途径

胆固醇代谢与其他脂质代谢密切相关，是脂蛋白代谢的一个组成部分。血清胆固醇水平高低反映了机体某些脏器的代谢障碍，如血清胆固醇升高的有关疾病有：①糖尿病（LDL）代谢异常等；②甲状腺机能降低（胆固醇转换成胆汁酸盐减少）；③胆汁淤滞症（排泄减少）；④家族性高胆固醇血症（LDL受体缺乏）；⑤肾病综合征（胆固醇合成亢进）。

血清胆固醇降低的有关疾病有：①甲状腺机能亢进症（转变成胆汁酸盐亢进）；②重病肝病（肝产生VLDL和HDL减少）；③吸收不良综合征；④营养失调；⑤无或低β脂蛋白血症（LDL减少）。如图1-4所示。

四、脂肪、磷脂、糖脂代谢

（一）脂肪代谢

脂肪的消化和吸收。膳食中的脂质主要为脂肪，此外还含少量磷脂，胆固醇等。在小肠经胆汁酸盐有作用，乳化并分散成细小的微团后，再被消化酶消化。小肠含有胰腺分泌的胰脂酶（pancreaticlipase,PL），磷脂酶A₂（phospholipaseA,PLA₂），胆固醇酯酶（cholesterylesterase）及辅脂酶（colipase）。胰脂酶特异催化甘油三酯的1及3位酯键水解，生成2-甘油一酯（2-monoglyceride,MG）及二分子脂肪酸。胰脂酶必须吸附在乳化脂肪微团水油界面上，才能作用于微团内的甘油三酯。辅脂酶能于胆汁酸盐及胰脂酶结合并促进胰脂酶吸附在微团的水油界面上，因而能增加胰脂酶的活性，促进脂肪的水解。磷脂酶A₂催化磷脂2位酯键水解，生成脂肪酸及溶血磷脂。胆固醇酯酶促进胆固醇酯水解成游离胆固醇及脂肪酸。

脂类消化产物主要在十二指肠下段空肠上段吸收。中链脂肪酸（6-10C）及短链脂肪酸（2C-4C）构成甘油三酯，经胆汁酸盐乳化后即可被吸收，在肠粘膜细胞内脂肪酶的作用下，水解为脂肪酸及甘油，通过门静脉进入血循环。长链脂肪酸（12-26C）及2-甘油一酯吸收入肠粘膜后，在光面内质网转酰酶（acylstransferase）的催化下，由ATP供给能量，2-甘油一酯加上2分子脂酰CoA，再合成甘油三酯。后者参入乳糜微粒的组成，经淋巴进入血循环。

（二）脂肪的合成

脂肪（酰基甘油三酯）是机体储存能量的形式。肝、脂肪组织及小肠是合成甘油三酯的主要场所，以肝的合成能力最强。

甘油三酯合成原料是由葡萄糖代谢提供的甘油及脂肪酸。甘油三酯合成的两条途径，一是小肠粘膜细胞内由消化吸收的甘油一酯及脂肪酸在转酰酶的催化下合成甘油三酯。二是在肝细胞及脂肪细胞进行的合成途径-甘油二酯途径。3-磷酸甘油在转酰酶的作用下，加上2分子脂酰CoA生成磷脂酸（phosphatidicacid）。后者在磷脂酸磷酸酶的作用下，水解脱去磷酸生成1，2-甘油二酯，然后在转酰酶的催化下，再加上1分子脂酰基即生成甘油三酯。

合成脂肪的三分子酸可为同一种脂肪酸，也可是三种不同的脂肪酸。合成所需的3-磷酸甘油主要由糖代谢提供。肝、肾等组织含有甘油激酶，能利用游离甘油，使之磷酸化生成3-磷酸甘油。脂肪细胞缺乏甘油激酶因而不能利用甘油合成脂肪。

（三）磷脂的代谢

1．甘油磷脂的合成和降解

甘油磷脂可在全身各组织细胞内质网合成，内质网含有合成磷脂的酶系。但以肝、肾及肠等组织最活跃，其合成原料是脂肪酸，甘油主要由葡萄糖代谢转化而来，但多不饱和脂肪酸必须从植物油摄取，其他原料如磷酸盐、胆碱（choline）、丝氨酸、肌醇（inositol）等可来自食物和体内合成。其合成过程有两种，一是甘油二酯合成途径。磷脂酰胆碱及磷脂酰及乙醇胺主要通过此途径合成；二是CDP-甘油二酯合成途径。肌醇磷脂（phosphatidylinositol）、丝氨酸磷脂（phosphatidyline serine）及心磷脂（cardiolipin）由此途径合成，具体过程如下。

以上是磷脂合成的基本过程。此外磷脂酰胆碱亦可由磷脂酰乙醇胺从S-腺苷蛋氨酸获得甲基生成。磷脂酰丝氨酸可由磷脂酰乙醇胺羟化或其乙醇胺与丝氨酸交换生成。甘油磷脂的合成是在内质网膜外侧面进行，而在胞液中存在一类能促进磷脂在细胞内膜之间进行交换的蛋白质-磷脂交换蛋白（phospholipidexchange proteins）。不同的磷脂交换蛋白催化不同种类磷脂在膜之间进行交换。合成的磷脂通过这类蛋白的作用转移至不同的细胞器膜上，从而更新其磷脂。

甘油磷脂的降解是由多种磷脂酶类（phospholipase）分别作用于甘油磷脂分子中的不同酯键。作用于1，2位酯键的酶分别称为磷脂酶A1和A₂，作用于溶血磷脂1位酯键的酶称为磷脂酶B₁，作用于3位磷酸酯键的酶称为磷脂酶C，作用磷酸取代基间酯键的酶称为磷脂酶D。通过以上多种酶的作用甘油磷脂最终分解为甘油、脂肪酸、无机磷酸。

2．鞘磷脂的代谢

全身各组织均可合成鞘磷脂，但以脑组织最为活跃。内质网有合成鞘氨醇酶系，鞘胺醇是各种鞘磷脂的前体物质，其合成过程为：

神经鞘磷脂以鞘氨醇为前体，在脂酰转移酶的催化下，其氨基与脂酰CoA进行酰胺缩合，生成N-脂酰鞘氨醇后，者由CDP-胆碱供给磷酸胆碱即生成神经鞘磷脂。

鞘磷脂的降解过程类似于磷脂的降解，在多种磷脂酶的作用下，可逐步水解。神经鞘磷脂酶存在于脑、肝、脾、肾等细胞的溶酶体中，属于磷脂酶C类，能够使磷酸酯键水解，产生磷酸胆碱及N-脂酰鞘氨醇。

（四）糖酯的代谢

1．糖基甘油酯的生物合成

糖基甘油酯分子是由糖类、甘油和脂肪酸组成的。其组成与磷脂的区别只是磷是基团被糖基所取代，因此合成过程与磷脂有许多相似之处。动物体内合成糖酯最活跃的器官是脑，亚细胞部位是微粒体。微粒体含有催化生成二半乳糖基甘油二酯的酶系。

2．糖基甘油酯的降解

脑组织含有脂肪酶和半乳糖苷酶催化半乳糖基甘油酯的水解反应。脑微粒体的半乳糖脂酶水解半乳糖基甘油二酯。动物体只有神经组织含有糖基甘油酯，其浓度在髓鞘形成期开始升高，因为它的合成速度最快，而水解酶活力又相应降低。由此表明糖脂参与了髓鞘形成的过程。糖脂降解产物是脂肪酸、半乳糖、甘油。

3．糖鞘脂代谢

哺乳动物的糖脂在肝脏和脾脏周转很快，但红细胞发育期动物的脑组织与内膜结合的糖脂半寿期却比较长。中性糖鞘脂的生物合成是通过在神经酰胺分子上顺序添加单糖而合成寡糖链，催化这一反应的酶总称为糖基转移酶，糖基供体是糖核苷酸衍生物（UDP-半乳糖，UD-P葡萄糖等，单糖从它的核苷酸衍生物转移给适宜的受体（底物）合成各种中性糖鞘脂。其中已糖苷神经酰胺的合成途径有两条。其一，是从鞘氨醇和UDP-半乳糖合成鞘氨醇半乳糖苷，由UDP-半乳糖：鞘氨醇β-半乳糖基转移酶催化，再经一个酰基转移酶合成1-0-半乳糖苷神经酰胺。但是已糖苷神经酰胺还是主要通过第二条途径合成的，即鞘氨醇首先酰化产生神经酰胺，后者再经UDP-半乳糖：N酰基鞘氨醇半乳糖转移酶催化合成1-0-半乳糖神经酰胺。

中性糖鞘脂的合成则是在多种糖基转移酶的催化下逐步合成的。如半乳糖基转移酶有催化生成α（1→4）糖苷键的酶，也有催化产生β（1→4）或β（1→3）糖苷键的酶；此外还有葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶β（1→3）和不止一种N-乙酰氨基半乳糖转移酶催化产生β（1→3）糖苷键和催化产生а（1→3）糖苷键。

葡萄糖苷酶、N-乙酰、β-氨基乙糖苷酶、α-岩藻糖苷酶、芳香基硫酸酯酶和神经酰胺酶。由于糖鞘脂的分子结构复杂，因此每一类酶呈现多样的底物专一性。糖硝酯被以上诸酶水解生成鞘氨醇、脂肪和酸糖基。

第三节　脂质的生理功能

如前所述脂质化学结构各异，因而具有多种生物功能，如贮存能量、组成生物膜；组成细胞表面的特殊物质如受体、识别因子等。

一、贮存能量

机体在正常生理条件下，由葡萄糖提供能量，葡萄糖增多首先可转变为糖原储存，继而转变为脂肪（甘油三酯）存入脂肪组织；另外，身体的生长、组织的修复和酶类的合成，要维持充足的蛋白质供应，多余的蛋白质也转变成脂肪贮存起来，当机体需要能量时首先动用糖原，其次才动用脂肪。

二、构成生物膜

生物膜结构不仅是细胞结构的组织形式，也是生命活动的主要结构基础。许多生命过程，如能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及神经传导，激素作用等都与生物膜有密切关系。生物膜（包括细胞表面膜即质膜和各种细胞器膜）是由脂质双分子层与镶嵌或附着在此双分子层内的蛋白质所组成的。生物膜结构的“流动镶嵌模型”说明脂质双分子层是生物膜的基本结构，磷脂组成了不连续的流动双分子层（此外尚有胆固醇和糖脂等），它作为内嵌膜蛋白的基质。也给各种不同大小的分子提供进出膜的通透性屏障。少部分磷脂含有特异性的脂肪酸链或特殊的极性头，能专一地与某些膜蛋白相互作用，从而执行特定的生物功能。生物膜的结构是相对稳定而又具流动性，其流动性取决于膜脂的脂肪酸组成和胆固醇含量，亦受温度的影响。在生理条件下生物膜的脂质和蛋白质分子能自由地在膜上进行侧向扩散，但从膜双分子层的一侧向另一侧翻转运动则比较困难。

生物膜的双分子层两侧表面呈现不对称分布。膜蛋白和膜糖在膜结构内不对称现象是绝对的，而膜脂的不对称现象不是绝对的，几乎各种类型的脂质都存于膜双分子层的两侧，但其含量与分布各异。脂质分子层作为膜的基本结构，含有品种繁多，化学性质各异的磷脂和少量糖脂。膜脂有共同的结构特点：它们都是两性分子，具有亲水的极性头和疏水的疏水尾。这种独特的结构特点使它在水溶液中，能自发地形成胶束或片状双层结构。由两排脂质分子构成的片状双层结构就是脂质双分子层。在脂质分子层内所有分子的极性头，都面向膜的两侧水溶相。在生物膜内磷脂以不对称的方式构成双分子层，这就是膜磷脂的拓扑结构不对称现象。膜磷脂通过各种膜结构之间相似磷脂分子重新分布进行周转与更新，从而维持磷脂在膜结构中不对称分布，这种磷脂在膜结构间的周转重排过程为磷脂交换，这是完整的磷脂分子交换过程。这种交换生物体内是相当普通的。磷脂分子通过交换，侧向扩散等维持自身的更新，修复或取代那些死去的细胞膜结构，保障细胞膜的通透性，控制着体内代谢产物的流失和外源有毒物的潜入，发挥着重要作用。

三、脂质的转化作用

通过转化生成相应的具有生物活性的物质，如胆固醇转化为相应的激素，后者在机体生长、发育、代谢发挥着不可取代的作用。由脂肪酸转化的前列腺素，而前列腺素近年来倍受重视，它对心血管系统的作用表现为增加心肌收缩性，降低动脉血压，同时伴随着血管扩张和增加血管通透性，前列腺素对大脑皮层有镇定和安定效应。前列腺素还能使支气管哮喘缓解而被用于治疗哮喘。另外，鞘磷脂、糖鞘酯是神经组织特有的物质，其作用不可忽视。还有一些维生素，如类萜维生素、维生素A、维生素E、维生素K是生命必需的物质。并且随着脂质研究的继续，一些重要作用将会被发现。总之，脂质对于生命的作用是巨大的。

（黄俊军）

（脂质化学及其代谢）参考文献

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10．陈丽筠编著，代谢（三），北京：科学出版社，1978

第二章　脂蛋白的组成与结构

正常人空腹血浆（血清）脂类浓度约为4g/L～8g/L。脂类一般均不溶于水，然而含有相当量脂类的血浆或血清却仍是清晰的。1929年Macheboeuf用半饱和（NH₄）₂SO₄沉淀出马血清中的脂质和蛋白质复合物，首次提出血浆中脂质是和蛋白质相结合成血浆脂蛋白（lipoprotein,LP）这是一类大分子复合物，可使非水溶性脂类分散在血浆中，使血浆清晰而不混浊。

1924年，Svedberg和Rinde率先发明了以油锅轮驱动的超速离心机来研究金的胶颗粒。1935年Mcfarlane用分析超速离心的方法分析血清，从超速离心图上发现血清蛋白界面不对称，认为可能有多种蛋白质存在，含有脂质的组分可以在清蛋白附近沉降，这一组分被称为X蛋白。

1948年，Gofman等在美国加州大学的Donner实验室开始了他的超速离心上浮脂蛋白和其他理化性质的研究，利用Beckman公司的装有电驱动的新型超速离心机，观察超速离心中蛋白质分子的界面移动行为，认为“X蛋白”是可以上浮的组分，在超速离心过程中会产生一种倒置的峰，实验证实了他们的预测，从而开始了以上浮方法来分离脂蛋白，为脂蛋白的研究开辟了一个新纪元。

随后，1958年Gitlin,1956年Walton和1972年Alaupovic等先后报道用密度梯度超速离心法将血浆脂蛋白分离为极低密度脂蛋白（very low densitylipoprotein,VLDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）三大类；其脂蛋白微胶颗粒中的蛋白质部分称为载脂蛋白（apolipoprotein,apoprotein,Apo），并分为：ApoA、ApoB、ApoC和Apod，某些载脂蛋白还有其亚组分。

图2-1 脂蛋白结构图

第一节　脂蛋白的种类

脂蛋白是由脂质和蛋白质组成的复合物。在脂蛋白内的脂质与蛋白质之间没有共价键结合，多数是通过脂质的非极性部分与蛋白质组份之间以疏水键相互作用而结合在一起。因此脂蛋白的物理特性与其所含的脂质组成和蛋白性质密切相关，如图2-1所示。

一、密度梯度分类法

根据脂蛋白颗粒的大小及其密度分类，即根据在特定的盐密度内的漂浮行为，用超速离心技术可把血浆脂蛋白分成四大族：

乳糜微粒（chylomicron, CM）：d<0.95g/ml

极低密度脂蛋白（VLDL）：d=0.95～1.006g/ml

低密度脂蛋白（LDL）：d=1.006～1.063g/ml

高密度脂蛋白（HDL）：d=1.063～1.21g/ml

现在用密度梯度分级分离、亲和层析、电泳等技术与浮选技术联合应用于脂蛋白的分离，发现上述四种脂蛋白还可以分成若干亚族：

中间密度脂蛋白（IDL或LDL₁）：d=1.006～1.019g/ml

低密度脂蛋白（LDL2）：d=1.019～1.063g/ml

高密度脂蛋白也是一种不均一的脂蛋白混合物，用物理方法至少可以再分成两个主要的亚族：

HDL₂：d=1.063～1125g/ml

HDL₃：d=1.125～1.210g/ml

另外还有极高密度脂蛋白（VHDL），密度范围为1.210～1.250g/ml。

表2-1 人血浆脂蛋白的种类及一般特性

*：s_f=svedberg单位(×10^-13cm/sec/dyne/gm)。括号内数字表示测定漂浮速率时的溶剂密度。

**：此类脂蛋白易变，直径为15nm,ApoE。

***Lp(a)也呈前β迁移率。

各类脂蛋白因密度及大小不同，含有不同种类和不同比例的脂质和载脂蛋白（见表2-1）。体积最大的脂蛋白为乳糜微粒，其内脂质占总量的98%，蛋白质仅占2%左右；体积最小的高密度脂蛋白颗粒内，脂质占总量的50%以下。乳糜微粒和极低密度脂蛋白代表运输甘油三酯的脂蛋白，都是从肝脏和肠把甘油三酯运送到其他组织，其代谢功能各不相同。乳糜微粒在小肠内形成，运输消化道内吸收的外源性甘油三酯（脂肪）；而VLDL专职运输肝脏和肠粘膜细胞合成及分泌的内源性甘油三酯。另外两类脂蛋白，LDL和HDL是携带胆固醇的运输工具。愈来愈多的证据表明，HDL作为一个反向运载工具，从外周把胆固醇运送回肝脏进行代谢，在清除胆固醇的过程中有重要的作用。

二、电泳分类法

根据脂蛋白的电泳迁移率进行分类

血浆脂蛋白是人体脂质代谢紊乱的敏感指针，因此在临床实践中，脂蛋白分离分析已成为常规检验指标。少量血清标本可以用电泳方法快速分离出各类脂蛋白，常用的支持介质有醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。

图2-2 超速离心法与电泳法分离血浆脂蛋白相应名称

醋酸纤维素薄膜电泳：特点是微量、快速、操作简便、吸附少、分离效果较好，能分离出α、前β、β及乳糜微粒等四条区带，有的血清有两条前β带。缺点是前β脂蛋白含量过高时会有拖尾现象，此外染色方法也不够理想，醋酸纤维素薄膜本身能被脂溶性染料着色，用苏丹黑B染色后背景深染，油红O虽然好一些，但脂蛋白带着色较浅。如用臭氧氧化后，碱性品红-亚硫酸试剂染色，所得图形清楚，背景着色较浅，缺点是染色步骤较繁，白蛋白部位有时染色过深。

琼脂糖电泳：琼脂糖是琼脂的主要成分，琼脂经处理惯除去其中的果胶后即为琼糖，由于琼脂糖中的硫酸根含量较琼脂少，电渗较弱，透明度高，对脂蛋白的分离效果比醋酸纤维素薄膜更好一些，可将血浆脂蛋白分成α、前β、β-脂蛋白和乳糜微粒。若用脂溶性染料染色，背景色浅，如将血清样品进行预染，可在电泳过程中直接观察分离效果，区带整齐，分辨率高高，重复性好。液相与固相无明显分界，电泳速度较快，干膜还可长期保存。缺点是需要临时制作凝胶板，不如醋酸纤维素薄膜方便。

聚丙烯酰胺凝胶电泳：兼有电泳和分子筛的双重作用，分辨率高，电泳时间短，分离的各脂蛋白带十分清晰。由于聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛的作用，能阻碍颗粒较大的前β-脂蛋白分子移动，所以前β-脂蛋白的区带落在脂蛋白的后面。

脂蛋白经上述三种电泳分离后，可用分段洗脱染料比色（不适用于圆盘电泳），或用光密度计扫描定量。以血清球蛋白迁移率作为参照，HDL与α球蛋白迁移在同一位置故称α-脂蛋白；LDL与β球蛋白迁移在同一位置，称为β-脂蛋白；VLDL区带迁移在β脂蛋白之前故称前β-脂蛋白；乳糜微粒留在原点样处不动。电泳技术是临床检验血清蛋白模式的有效手段，因此这种命名法常应用于临床检验，如图2-2所示。

三、以载脂蛋白组成作脂蛋白颗粒分类

传统的脂蛋白分类是根据其密度和电泳行为分类，但是每一类脂蛋白不仅密度、大小、脂蛋白比是不均一的，载脂蛋白的组成也不同，载脂蛋白是唯一具有化学和免疫学独立特性的脂蛋白的组成部分，所以要进行准确的脂质运转研究，用传统的以物理性质分类的方法是有缺陷的。

Alaupovic提出将载脂蛋白组成作为鉴定脂蛋白颗粒的标志及脂蛋白分类的基础。每个脂蛋白颗粒只含一种载脂蛋白称为单脂蛋白，如LDL中多数脂蛋白只含ApoB₁₀₀，称为脂蛋白B（LpB）；若含有二种或二种以上不可分离的载脂蛋白叫复脂蛋白，如LDL中的脂蛋白颗粒含有ApoB、CI、CⅡ和CⅢ，称为LpB：CⅠ：CⅡ：CⅢ（LpB：C）。单脂蛋白和复脂蛋白是大颗粒脂蛋白体系中基本的化学实体，可以有不同的密度、大小、脂/蛋白比，但载脂蛋白的性质不变，具有特定的功能和代谢特征。

按Alaupovic提出的分类方法，ApoA和ApoB组成不同两类主要的脂蛋白颗粒，前者主要存在于HDL，而后者主要存在于VLDL和LDL中，每种都可分为单脂蛋白和复脂蛋白。含有ApoA的脂蛋白颗粒主要有LpAⅠ和LpAⅠ：AⅡ，含ApoB的脂蛋白颗粒有LpB，LpB：E，LpB：C，LpB：C：E和LpAⅡ：B：C：D：E等。

分离脂蛋白颗粒的方法主要是免疫亲和层析。

（1）含ApoA脂蛋白颗粒的分离：从ApoAⅡ抗血清提取免疫球蛋白（IgG），用抗ApoAⅡ-IgG与吸附剂交联制备免疫吸附柱，用pH7.0磷酸盐缓冲液平衡，将新鲜血清或HDL过柱，柱上保留的部分为LpAⅡ和LpAⅠ：AⅡ，滤出未保留的部分主要为Lpa Ⅰ，用3mol/L硫氰酸钠洗脱LpAⅡ和LpAⅠ：AⅡ，透析。分别将保留的部分洗脱的部分，通过抗ApoAⅠ-IgG交联的吸附柱，分离LpAⅠ、LpAⅠ：AⅡ、LpAⅡ和其他脂蛋白颗粒。用免疫扩散及免疫电泳方法鉴定LpAⅠ和LpAⅠ：AⅡ的载脂蛋白的组成。血浆中大约35～45%的ApoAⅠ存在于LpAⅠ，而55～60%存在于LpAⅠ：AⅡ，LpAⅠ占总的含ApoA脂蛋白的20～28%，LpAⅠ：AⅡ占72～80%，与LpAⅠ：AⅡ相比，LpAⅠ具有较高的胆固醇和较低的蛋白质组成，LpAⅠ和LpAⅠ：AⅡ的平均颗粒大小分别为379000和269000。

（2）含ApoB脂蛋白颗粒的分离：含ApoB脂蛋白颗粒可采用免疫亲和层析法，将VLDL和LDL中的脂蛋白颗粒分为富含胆固醇酯的LpB、LpB：E和富含甘油三酯（TG）的LpB：C，LpB：C：E和LpAⅡ：B：C：D：E等，其中LpB是主要的单脂蛋白，主要存在于LDL₂中LpB：C和LpB：C：E是主要的复脂蛋白，随着密度的增加，胆固醇和胆固醇脂的含量升高而TG含量降低。

尽管对含ApoA和ApoB脂蛋白颗粒的功能和代谢研究还处在早期发展阶段，但已有许多证据表明，以载脂蛋白组成分类的脂蛋白颗粒具有功能一致性和代谢均一性，并有特定的致动脉粥样硬化（AS）作用或抗AS功效。

据报道，LpAⅠ和LpAⅠ：AⅡ具不同的功能和代谢特征。卵磷脂酯胆固醇酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酯转运蛋白（CETP）主要存在于Lpa I而不存在LpAⅠ：AⅡ中。一项对有早发心肌梗塞家族史的青少年的研究表明，家族史与LpAⅠ有明显负相关，而与LpAⅠ：AⅡ无关，并认为，HDL抗动脉粥样硬化的功效在LpAⅠ，而不是LpAⅠ：AⅡ。含ApoB的脂蛋白颗粒，若ApoE/ApoC升高，则分解速度快。实验证明，ApoE含量升高，加快鼠灌注肝脏对富含TG脂蛋白的吸收，而ApoC则降低这一吸收；另外富含TG脂蛋白的降解速度不仅依赖于脂蛋白脂酶（LPL）的含量和活性，还与脂蛋白颗粒中LPL底物的反应性有关，如LpAⅡ：B：C：D：E的脂含量及脂蛋白质比与LpB：C和LpB：C：E很相似，而与LPL反应的速率常数比后两者低得多，水解速度慢，表明载脂蛋白组成对脂蛋白颗粒的分解代谢有重要影响。含ApoB脂蛋白颗粒也有不同的致AS作用，例如家族性高胆固醇血症（FH）病人的特点是LpB和LpB：E水平升高，LpAⅠ和LpAⅠ：AⅡ无明显变化；而高TG血症则伴随着LpB：C、LpB：c：E和LpAⅡ：B：C：D：E的升高及LpAⅠ和/或LpAⅠ：AⅡ的降低。富含TG的LpB脂蛋白颗粒也具有重要的致AS作用。如Ⅱa型病人LpB水平高。

四、其他脂蛋白的分类法

脂蛋白（a）[Lipoprotein(a),Lp(a)]由Berg在1963年制备LDL抗体过程中发现，当时测定Lp(a)在北欧人群分布率为30%，目前采用更灵敏的方法已发现其几乎存在于所有人群中，只是在血浆的浓度差异极大,从小于1mg/dl到大于100mg/dl。更重要的是Lp（a）在血浆中的水平与冠心病密切相关，其结构与纤维酶原极其相似。Lp(α)上浮密度在1.05～1.10g/ml，球型颗粒，直径为2.35～26.0nm，分子量4.6～5.6×10⁶,Lp(α)在琼脂糖电泳中位于前β位置。Lp(a)含有ApoB₁₀₀和Apo（a）两类载脂蛋白，前者与LDL的ApoB₁₀₀相同，后者是Lp（a）的独特载脂蛋白。ApoB₁₀₀与Apo（a）能通过1至2个二硫键共价相连，当用还原剂巯基乙醇或二硫苏糖醇处理Lp（a）时，Lpo（a）可从Lp（a）的分子上脱落下来，成为不含脂质的一类糖蛋白，剩下不含Apo（a）仅含ApoB₁₀₀的颗粒称为Lp（a^-）。

脂蛋白X：胆汁郁积时可特异地出现异常脂蛋白一脂蛋白X（lipoprotein,LpX）它是1969年由Seidel命名的。LpX上浮密度为1.035～1.063g/ml,直径40.0～60.0nm,厚度10.0nm，呈磷脂双层膜的圆盘状囊泡。LpX在正常成人为阴性，有报告6个月内机新生儿呈阳性者。LpX可作为诊断胆汁郁积的较灵敏的生物化学指标。

第二节　脂蛋白的化学组成

脂蛋白的物理学特性与它们的脂质组成和含量密切相关，脂蛋白包含各种脂质分子，脂蛋白内的中性脂质含量增高则脂蛋白颗粒的密度下降。而脂蛋白的化学和生物学特性与其所含的载脂蛋白密切相关，因此我们用表2-2列出几种主要的脂蛋白的化学组成。

表2-2　人血浆脂蛋白的化学组成

载脂蛋白的百分构成比（%）

载脂蛋白
AⅠ	+	-	-		65
AⅡ	-	-	-		25
B		40	>95	-
CⅠ		10	-	1-2
CⅡ		10	-	1-3
CⅢ		30	痕量	4-6
D(A-Ⅲ)	?	-	-	+	+
E	+	5-10	-	+	+

磷脂的百分构成比(%)

一、脂质

从表2-2可见，乳糜微粒和VLDL含有大量的甘油三酯和胆固醇酯，其密度相应较小。除乳糜微粒外，其他脂蛋白（VLDL、LDL、HDL）所含的极性脂质（磷脂）的百分比大致相近。

高密度脂蛋白含有25%～30%的磷脂，其中磷脂酰胆碱磷脂总量的75%，鞘磷脂占13%，还有12%是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和溶血卵磷脂；低密度脂蛋白含有22%的磷脂，其中磷脂酰胆碱占磷脂总量的65%，鞘磷脂占25%，其他磷脂占10%。

各种脂蛋白的个别脂质的脂肪酸组成亦有所不同。

各类脂蛋白的差别还在于卵磷脂和鞘磷脂的相对摩尔比例，酯化的胆固醇和胆固醇的摩尔比例（ChE/Ch），以及总磷脂与总胆固醇的摩尔比例（PT/Ch）。PL/Ch的比值在VLDL和HDL中比LDL高；ChE/Ch比例在LDL和HDL比VLDL高。这些变化反映脂蛋白内极性脂质与非极性脂质之间比例的变动。

LDL是人血浆的主要脂蛋白，约占脂蛋白总量的50%左右，这一族脂蛋白富于胆固醇及胆固醇酯，占其总脂质的50%以上。LDL携带的胆固醇量为血浆内胆固醇总量的40%。

新生儿血浆的HDL含量比成人高，VLDL极少，随着年龄增长，血浆内LDL和VLDL含量增加。

二、载脂蛋白

1965年Eder首次用载脂蛋白表示脂蛋白颗粒中的蛋白质。经超速离心浮选技术和差速区带超速离心技术结合柱层析技术分离出各种脂蛋白及若干脂蛋白亚族，再通过脱脂处理得到多种载脂蛋白的混合物，凝胶过滤、离子交换柱层析、等电点聚焦分离和凝胶切割等技术亦可用于分离载脂蛋白。最大的乳糜微粒只含2%或更少的载脂蛋白，而最小的HDL颗粒所含的载脂蛋白高达50%以上。近年来分离并鉴定出许多载脂蛋白，几种主要载脂蛋白在人血浆中的含量与在脂蛋白中的分布见表2-3。

表2-3 主要载脂蛋白在人血浆中的含量与在脂蛋白中的分布

^*：为ApoB₄₈，其他为ApoB₁₀₀

近年，由于研究蛋白质方法学的进步，也促进了对载脂蛋白的深入探讨。目前已查清了主要载脂蛋白的一级结构和部分空间结构，见表2-4，并进一步研究结构和功能的关系。载脂蛋白在稳定脂蛋白构型，结合与转运脂质，调节脂蛋白代谢关键酶活性，识别脂蛋白受体，调节脂蛋白代谢以及提供脂蛋白的免疫原性等方面具有重要作用。

表2-4 人血浆的主要载脂蛋白

*：二聚体；

**：Apo（α）有多种异构体，分子量在300000-80000之间。

三、其他脂蛋白的化学组成

Lp（a）是一独立存在的脂蛋白系统，脂质成分和低密度脂蛋白极为相似，蛋白部分由ApoB₁₀₀和一富含神经氨酸的糖蛋白即Lp（a）的特异性抗原载脂蛋白（a）[Apo（a）]组成。表2-5列出LDL与Lp（a）之间差异。

表2-5 LDL、Lp（α）和Lp（α^-）的化学组成

LpX的组成特点是其中所含的载脂蛋白非常少（5.8%），而磷脂、胆固醇等脂质成分非常多（94%）。载脂蛋白中ApoC占60%，白蛋白占40%，完全不含ApoB。其化学组成见表2-6。

表2-6 LpX的化学组成

蛋白质及脂质组成
蛋白质	5.8%
胆固醇酯	2.4%
游离胆固醇	22.4%
磷　 脂	66.5%
甘油三酯	2.9%
胆汁酸含量	2.3%（重量）
石胆酸	13%
脱氧胆酸	23%
鹅脱氧胆酸	11%
胆酸	53%
载脂蛋白组成
	60%
白蛋白	40%
ApoD	微量

第三章　载脂蛋白的种类与结构

脂蛋白中的蛋白部分称为载脂蛋白（apolipoprotein/apoprotein,Apo）。载脂蛋白在脂蛋白代谢中具有重要的生理作用。作为构成并稳定脂蛋白的结构是脂蛋白结构的支柱；修饰并影响脂蛋白代谢有关的酶活性；作为脂蛋白受体的配体；参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的结合代谢过程。

载脂蛋白种类很多，一般分为5～7类，其氨基酸序列大多数已阐明，载脂蛋白种类的命名是按1972年Alaupovic建议命名方法，用英文字母顺序编码，每一类还有亚类。

第一节　载脂蛋白A族

载脂蛋白A（ApoA）可分为ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoAⅣ。ApoAⅠ和ApoAⅡ大部分布在HDL中，是HDL的主要载脂蛋白。

一、ApoAⅠ

ApoAⅠ是ApoA族最多的一种组分，是HDL中的主要载脂蛋白。Shore等于1968年首先从人HDL中分离纯化得到ApoAⅠ。70年代中期Brewer阐明了ApoAⅠ的氨基酸序列，并预测了其二级结构的要点。在分子生物学兴起的80年代，Karathanasis等人相继报道了人ApoAⅠcDNA和染色体DNA序列。人成熟的ApoAⅠ的由243氨基酸残基组成，是单一多肽链，分子量为28300D。人及大鼠、猴、兔、牛、鸭、树鼷等动物的ApoAⅠ已分离纯化。人和其他种属的ApoAⅠ的氨基末端为Asp，羧基末端为Gln，其分子中不含半胱氨酸和异亮氨酸。经等点聚焦电泳证实人和动物的ApoAⅠ都是不均一的，有10种不同的亚组分，至少有六种多态性。经等电聚焦和双相电泳中的系统命名，ApoAⅠ多肽性依次称为Apoa Ⅰ、ApoAⅠ_-1、ApoAⅠ_-2、ApoAⅠ₊₁、 ApoAⅠ₊₂，其中ApoA Ⅰ含量最多。

目前所知，ApoAⅠ的氨基酸残基的排列有其自身的特征：①极性氨基酸残基含量较多，多以1、2或1、4相反离子对的形式排列，即Glu-Arg、Glu-Lys或Asp-Lys、Asp-Arg；②疏水氨基酸残基一对对地出现在1、2或1、4反离子对的附近，并很容易形成特有的双性螺旋二级结构。极性与非极性氨基酸残基排更的这种方式是载脂蛋白的一个共性。由疏水氨基酸残基组成螺旋的排极性面和由带电荷亲水的氨基酸组成的螺旋极性面，故称为双性螺旋，这也是载脂蛋白α-螺旋的共性，并与一般蛋白质的α-螺旋有不同之处，只有这种双性螺旋既有亲脂的一面又有亲水的一面。ApoAⅠ富含双性螺旋结构，对于维持其正常的生理功能是非常重要的。

ApoAⅠ主要存在于HDL中，占HDL₃载脂蛋白的65%，占HD₂载脂蛋白的62%。在CM、VLDL和LDL中也有少量存在。血浆中呈现β迁移率的一种β-HDL，其中有80%的ApoAⅠ。

ApoAⅠ的生理功能有：①组成脂蛋白并维持其结构的稳定与完整性。实验表明，纯化的ApoAⅠ在水溶液中可以自发地和脂类结合。70年代早期，Gotto实验室研究了人ApoAⅠ分子与磷脂的结合部位，用CNBr法将ApoAⅠ裂解成四个肽段，发现仅有羧基末端的肽段可自发地和磷脂结合。后来进一步确认该段是ApoAⅠ224-242肽段，这一肽段既可以维持双性螺旋的结构又可以维持和脂质结合所具备的疏水性；②ApoAⅠ可以激活磷脂胆固醇酰基转移（LCAT）的活性。已经证实ApoAⅠ是通过激活LCAT，再催化胆固醇酯化，ApoAI肽段Ⅲ（肽段116-151）是激活作用的中心；③其他，有学者报道，ApoAⅠ可作为HDL受体的配体；含ApoAⅠ脂蛋白可以和转铁蛋白及铜蓝蛋白形成大分子复合物以运输铁和铜离子。

ApoAⅠ由肝和小肠合成，血浆中生物半寿期为4.5天。

二、ApoAⅡ

ApoAⅡ是HDL中第二种含量多的载脂蛋白，在HDL₂占载脂蛋白的15%，在HDL₃中占载脂蛋白的25%。CM中达总载脂蛋白的7%～10%，VLDL中也少量存在。直到1985年，ApoAⅡ蛋白质的氨基酸序列、cDNA序列及基因序列均已阐明。ApoAⅡ是由两条多肽链的77个氨基酸残基组成。ApoAⅡ在不加还原剂的SDS-PAGE中测出分子量是17000D，在人血浆中以二聚体形式存在。ApoAⅡ的单体分子量为8700D。人ApoAⅡ蛋白C端氨基酸残基为谷氨酸，N端为吡咯烷酮酸，缺乏组氨酸，精氨酸及色氨酸。ApoAⅡ有多态性存在，最主要的多态型等电点为4.9，而含量较少的多态型的等电点为5.17、4.68、4.42和4.20。

ApoAⅡ的生理功能是：①维持HDL结构，ApoAⅡ肽段12-31和肽段50-77具有与磷脂的结合能力，经二级结构分析认为，残基17-30和51-62形成的双性螺旋结构是人ApoAⅡ与脂质结合的分子基础；②激活肝脂酶，用以水解CM和VLDL中的TG和PL。还有报道，ApoAⅡ可抑制LCAT活性。

ApoAⅡ由肝脏和小肠合成。人血浆中的ApoAⅡ生物半寿期为4.4天。

三、ApoAⅣ

ApoAⅣ是最先从大鼠DHL和CM中发现的一种载脂蛋白，1979年Beisiegel等人证实了人血浆中也有ApoAⅣ存在，其主要分布于密度大于1.211g/ml部分。成熟ApoAⅣ由376个氨基酸残基组成。经SDS-PAGE确认大鼠和人ApoAⅣ分子量为44000和46000Da。人和大鼠氨基酸组成相似，是一种糖蛋白，含有6%的碳水化合物，其中甘露糖占1.8%，半乳糖占1.55%，N-乙酰葡萄糖胺占1.55%和唾液酸占1.1%。ApoAⅣ蛋白存在多态性，生物半寿期为10h。

ApoAⅣ的生理功能目前尚不清楚，据推测它在HDL逆向转运过程中起有重要作用。1985年Steinmetz等报道，在体外，ApoAⅣ可以促进LCAT的胆固醇酯化反应。Goldberg报道，ApoAⅣ起有调节脂蛋白脂肪酶的激活作用，并推测可以促进ApoAⅣ从HDL和VLDL中释放。ApoAⅣ由肝脏和小肠合成。

第二节　载脂蛋白B族

体外实验表明，载脂蛋白B是难溶于水的蛋白质。目前所知，ApoB族可分为两个亚类，即ApoB₄₈和ApoB₁₀₀。ApoB主要成份是B₁₀₀，其次为B₄₈，其他形式如ApoB₇₅，ApoB₄₁，ApoB₃₆等均为ApoB₁₀₀的不同降解产物。

一、ApoB100

从1966年Margoli和Landgon开始研究ApoB₁₀₀的结构，不同实验室以特异性蛋白水解酶或化学裂解法研究ApoB的结构，所得ApoB纯度均不尽人意。作者曾于1986年采用特殊的沉淀抽提法获得高纯度的血清ApoB₁₀₀纯品，以化学裂解法在国内首先报道了ApoB₁₀₀纯品的氨基酸组成，与Ologsson报道的结果基本一致，如表3-1所示。

表1 人的ApoB₁₀₀的氨基酸组成

1986年杨朝谕采用生物化学方法,得到人LDL的ApoB₁₀₀纯品并测出了ApoB₁₀₀一级结构的氨基酸排列顺序,其结果与从cDNA推导的序列完全一致,从而解决了二十余年悬而未决的难题。

ApoB₁₀₀是单链糖蛋白，分子量为510kD，主要在肝脏，少数在小肠合成。ApoB₁₀₀包括27个（或24）氨基酸信号肽和4536个氨基酸残基的成熟单体蛋白。1986年ApoB₁₀₀的全部氨基酸残基排列顺序结构已阐明。ApoB₁₀₀分子中含有25个Cys残基，其中有11个Cys残基集中分布在前面500氨基酸组成区域，形成链内二硫健，所以N端高度交联成典型球形结构，Cys残基通过硫脂键与软脂酸硬脂酸以共价键相结合，使ApoB牢固地连接着脂质成份。ApoB₁₀₀中对脂类结合的必要的结构区域在2035～2506和4002～4527氨基酸残基之间，这两个结构区域重复出现两性亲脂α-螺旋区段。另有一种结合脂质的重要结构是含疏水和亲水性氨基酸交替排列两性亲脂β-折叠结构，这种结构分布在整个分子序列中，但集中于四个富含脯氨酸域，这种富含脯氨酸的重复序列是ApoB₁₀₀所特有的，使ApoB₁₀₀能够将磷脂侧链深埋其间并使之紧密结合。由于ApoB₁₀₀的两性α-螺旋和富含脯氨酸的疏水肽及可被脂酰化的Cys残基形成特殊结构，使得ApoB₁₀₀能够与单层极性脂牢固地结合并有许多脂质结合区，并使其在VLDL和LDL从分泌到被清除的整个过程中，ApoB₁₀₀不在脂质白分子间转换，这是与其他载脂蛋白不同之处。LDL上的ApoB₁₀₀结构如图3-1所示。

图3-1 LDL上的ApoB₁₀₀结构图

ApoB₁₀₀生理功能有：①合成装配和分泌富含甘油三酯的VLDL；②是LDL的结构蛋白；③是LDL受体的配体，调节LDL从血浆中的清除速率。

二、ApoB48

ApoB₄₈因分子量是ApoB₁₀₀的48%而得名。存在于CM中，不与其他脂蛋白分子交换。ApoB₄₈在小肠合成，是组装CM所必需的载脂蛋白。由小肠细胞分泌后进入淋巴液，并通过胸导管再进入血液循环，CM再分布到毛细血管的内皮细胞，主要是骨骼肌和脂肪组织的毛细血管内皮细胞，脂肪酶可水解CM中甘油三酯的80%～90%，剩下的脂蛋白颗粒则称为CM残粒，再送到肝脏，被肝脂酶进一步水解代谢，最后被能识别ApoE的残粒受体摄取。该残粒受体是LDL受体，还是LDL受体相关蛋白或其他蛋白质，目前还不清楚。

ApoB₄₈在血浆中生物半寿期仅5～10min，因为分解速度很快，在血清中的浓度很低，约相当于ApoB₁₀₀的0.1%。经SDS-PAGE电泳染色在VLDL组分中，仍可检出痕量的ApoB₄₈。摄入含脂肪丰富的食物后，ApoB₄₈/ApoB₁₀₀比值明显增加。

第三节　载脂蛋白C族

载脂蛋白C是目前所知载脂蛋白中分子量最小的一类。50年代Shore等分别报道，VLDL中ApoA和B外，还有第三种载脂蛋白。Gustafson等人从VLDL中分离出一种含有少量磷脂的低分子量载脂蛋白，并命名为载脂蛋白C，此后又在HDL中发现有ApoC。1969年Brown等进一步确认ApoC有三种亚型，即ApoCⅠ、ApoCⅡ、ApoCⅢ。

ApoCⅠ由57个氨基酸残基组成的单一多肽链，其序列已测出，不含半胱氨酸、组氨酸和酪氨酸，分子量为6625D。人ApoCⅠ二级结构中有55%的α螺旋结构，极易与磷脂结合。它是LCAT的激活剂。

ApoCⅡ由79个氨基酸残基组成的单一多肽链，氨基酸顺序已测出，分子量为9110D，有两种多态型，等电点分别为4.86和4.69，均不含半胱氨酸和丝氨酸，其二级结构的α螺旋约占23%。ApoCⅡ可激活多种来源的脂蛋白脂肪酶（LPL）。其结构中第55～78位氨基酸残基是维持其对LPL激活作用的最短必需区域。羧基端43～50位氨基酸残基为α-螺旋结构的脂质结合。

ApoCⅢ由79个氨基酸残基组成单一多肽链，由于第74位苏氨酸残基所带唾液酸个数不同，又可分成ApoCⅢ、CⅢ₁、CⅢ₂三个亚类，也是其多态性，等电点分别为5.02、4.82和4.62。Brewe等已测出ApoCⅢ氨基酸序列，分子量为8764D，其二级结构在不同状况下，α-螺旋约占22%～54%不等，ApoCⅢ的α-螺旋结构极易与磷脂结合。

ApoC族生理功能有：①同磷脂相互作用，维持脂蛋白结构，由于在溶液中呈特殊的立体双性离子，带负电荷的酸性氨基酸与带正电荷的磷脂基团作用，具有很强的磷脂结合活性。由于与磷脂交互作用，ApoC族的α-螺旋结构增加，而磷脂的单个酯酰链的运动则受到限制，从而影响磷脂从凝胶态到液晶态的转变，两者作用结果达到固系脂蛋白结构功能；②对酯酶的激活作用。有人认为HDL的磷脂流动性增加时，ApoCⅠ通过HDL脂层表面后促进LCAT的催化作用；③ApoCⅡ可以激活LPL，其激活机制可能是，LPL通常存在于外周循环与肝素样分子结合并附着于血管内皮上，当LPL接触CM或VLDL时，LPL便同脂蛋白颗粒表面的磷脂发生作用，进而结合于脂蛋白颗粒上，其内的ApoCⅡ与LPL发生作用，改变LPL的空间结构，进而催化水解甘油三酯。

ApoC主要由肝脏合成，小肠也合成少量。

第四节　载脂蛋白E

一、ApoE的蛋白结构

载脂蛋白E是一种富含精氨酸的碱性蛋白，人ApoE299个氨基酸残基组成，分子量为34145D，含32个Arg和12个Lys存在于血浆的CM、VLDL及其残粒和β-VLDL中均含有ApoE，一部分ApoE在血液中与ApoAⅡ形成复合体。

Shore于1973年首先发现ApoE，Rall等于1982年测出ApoE的蛋白质一级结构，其后Taylor建立ApoE的cDNA序列，Breslow 和Zannis首先测出ApoE有3个等位基因异构体以及基因在染色体上的定位。据推算和测定，在介质中ApoE有62%的α-螺旋，9%的β-片层，11%的β-转角和18%无规则线团。ApoE分子可以被凝血酶水解为二个区域，N-端区（1～191）为22kD的可溶性球蛋白，此区域较稳定，该片段的136～158位肽段为受体结合位点，富含碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸），也属于肝素结合区。此片段为一个反平行的四螺旋束，是α-螺旋蛋白的一般折叠方式。C端区（216～299）分子量为10kD，螺旋程度很高，不稳定，是与脂蛋白的结合区。用截去了末端的变异体及合成多肽片段进行ApoE羧基末端的检测表明，191残基以外羧基端存在三个螺旋，其中两个为A型（203～223和225～266），第三个（268～289）为一种G型螺旋。与脂类或不同的脂质微粒或二甲基磷脂酰胆碱结合的结果说明，G螺旋和第二螺旋的末端在脂质连结，在ApoE的四聚体化过程中起重要的作用。更精确地说是263～286片段可能在脂连结ApoE与VLDL的结合中起有关键作用。ApoE主要由肝脏合成，近年来发现脑，肾，骨骼，肾上腺及巨噬细胞也能合成。ApoE其结构如图3-2所示。

图3-2 载脂蛋白E结构示意图

二、ApoE的生理功能

ApoE生理功能有：①是LDL受体的配体，也是肝细胞CM残粒受体的配体，它与脂蛋白代谢有密切相关性；②ApoE具有多态性，多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关；③参与激活水解脂肪的酶类，参与免疫调节及神经组织的再生。

人类ApoE主要在肝脏和脑组织合成，在其他组织包括单核细胞（含巨噬细胞）也有合成能力。人的肾上腺、卵巢颗粒细胞也能合成ApoE。脑中ApoE的mRNA表达总量是肝脏的1/3，星形细胞是其主要合成部位。脑中生成的ApoE的作用可能是使细胞内的脂类重新分配而保持脑环境中的胆固醇平衡。脑肿瘤中发现有高浓度的ApoE，推断它可能作为神经胶质细胞瘤的标记。

三、ApoE多态性

Utermann等于1975年首先观察到ApoE多态性，利用等电聚焦电泳和SDS-PAGE可以确认ApoE的多态性，其后又被直接检测的cDNA序列所证实。ApoE有三种构体（isoform）即E₂、E₃和E₄。有的人只含有一种主要异构体，即为纯合子；有人可含两种主要异构体，即为杂合子。由此可见，人群中可有六种不同的表型（phenotype）。

各种生物都能通过生殖产生子代，子代和亲代之间，无论在形态构造或生理机能的特点上都很相似，这种现象称为遗传（heredity），但是，亲代和子代之间，子代的各个体之间不会完全相同，总会有所差异，这种现象叫变异（variation）。遗传和变异是生命的特征。遗传和变异的现象是多样而复杂的，正因为如此，才导致生物界的多种多样性，生物体所具有的遗传性状称为表型或表现型（phenotype），生物所具有的特异基因成分称为基因型（genotype）。表型是基因型与环境因素相互作用的结果。遗传物质是相对稳定的，但又是可变的，遗传物质的变化以及由其所引起表型的改变，称为突变（mutation）。遗传物质的突变包括染色体畸变和基因突变。基因突变是染色体中某一点上发生化学改变，所以又称为点突变（point mutation）。基因结构和遗传表型的研究是深入了解脂蛋白代谢缺陷症的分子生物学基础，逆向遗传学方法（reversegenetic approach）则使其有可能在蛋白质水平系统地分析结构和功能的关系。现已采用一个特定的cDNA探针从基因库中筛选所需要的基因进行cDNA克隆，测定其核苷酸序列，然后从核苷酸序列推断蛋白质氨基酸序列。目前已分离出许多与动脉粥样硬化有关的脂蛋白的cDNA克隆，并将其蛋白质一级结构的氨基酸排列顺序和基因的核苷酸顺序测出。现已查明，ApoAⅠ,ApoⅣ,ApoE, ApoB, ApoCⅡ和Apo（a）都存在着异构体，也就是说存在着各种不同的表型或基因型，并可分别从蛋白质水平和核酸水平进行分型。

Zannis于1981年根据ApoE表型提出ApoE基因模型，认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制，即E₂、E₃和E₄，每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子（E2/2，E3/3，E4/4）和三种杂合子（E2/3，E2/4，E3/4）共六种常见表型，另外还有极少见的异构体。一般认为，次要异构体是由主要异构体翻译后，经唾液酸糖化修饰后转变而来。ApoE3/3型又称野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位两种氨基酸残基即精氨酸（Arg）和半胱氨酸（Cys）的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg；E₂都是Cys；112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体，见图3-3所示，自然人群中，基因频率ε3分布最高，ApoE3/3表型分布约70%。

图3-3 人ApoE三种主要异构体的氨基酸残基及基因密码的改变位置

由于ApoE多态性具有生物学重要性，对ApoE多态性的研究是目前医学的热门话题。ApoE表型和基因型的检测方法很多，多年来先后采用等电聚焦电泳和基因分析术进行检测。目前从基因水平研究ApoE基因型显然优于其蛋白表型，因为ApoE翻译后修饰会影响蛋白分析，常见ApoE的蛋白表型和基因型图谱如图3-4、图3-5所示。

图3－4　等电聚焦检测的ApoE表型

图3-5 ApoE基因PCR产物HhaⅠ酶切后RFLP图谱

M：PBr 322 DNA/Hhe Ⅲ Markers;1-5；分别为ε4/4、ε4/2、ε4/3和3/3；基因型6：PCR产物（292bp）

四、ApoE多态性与疾病

人群中ApoE多态性存在种族变异，不同人群中ApoE基因型高度不同。欧洲人ε4等位基因频率从北到南呈下降趋势的分布。亚洲人ε4频率低，相比之下，非洲人及巴布比亚和新几内亚ε4频率高。

由于早期观察到ApoE2/2表型的Ⅲ型高脂蛋白血症病人未在成年即患冠心病，从此，对ApoE多态性进行了广泛研究，许多证据认为，ApoE多态性是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因。大量人群调查发现ε4等位基因的一般作用是可以显着地升高健康人的总胆固醇浓度，使之易患动脉粥样硬化，相反，ε2等位基因的一般作用是降低胆固醇浓度，其降低效应是ε4升高胆固醇的2～3倍。ApoE等位基因变异还与血浆ApoB浓度、甘油三酯及血管收缩压有关。Menzel等认为ε2等位基因对冠状动脉硬化的发展有防护作用，经临床研究发现，患心血管疾病如心肌梗塞幸存者，或血管造影证明有动脉粥样硬化者，比其对照组的ε4等位基因频率高。ApoE4/3杂合子比E3/2和E3/3基因型者发生心肌梗塞年龄早。ApoE多态性变异还与肾病综合症、糖尿病有关。

值得重视的是ApoE多态性与老年性痴呆病（AD）的关系。1993年，Rose研究发现，晚发性家族型AD病人ε4频率增多，还发现ApoE和来源于淀粉样前体蛋白的小多肽Aβ的亲和力很高。其后陆续发现AD病人中携带ε4等位基因者占46.2%，而对照组占13.2%。还发现携带二个ε4等位基因的研究对象比携带一个ε4的研究对象发生AD年龄早，比不携带ε4等位基因的研究对象发生AD年龄更早，1994年，Schacher等人相继报道百岁老人普遍携带ε2基因。。这一发现使ApoE多态性和研究向前迈出了一大步。有报道高老年人携带ε2等位基因数量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不仅可以保护人们免患AD，而且还与长寿有关。ApoE多态性与AD的关系，目前的研究主要集中在脑代谢中与Aβ或Tau蛋白以及神经元生长和分枝等有关。

总之，在研究高脂血症评定心脑血管疾病的危险因素方面，以ApoE多态性为手段进行研究有重要的临床意义。有学者认为，基因型的“坏”（ε4）和“好”（ε2）的等位基因之间的平衡，可作为基因分析应用于医学检验领域，协助临床疾病的诊断。

第五节　载脂蛋白（a）

脂蛋白（a）[LP（a）]是1963年Berg研究β-脂蛋白的变异型时发现的，当时测定脂蛋白（a）在人群分布率为30%。目前采用更灵敏的方法发现几乎存在于所有人群中，仅是血浆浓度差异很大，波动在0～1000mg/L的范围。Eaton和Melean等于1987年克隆了人Apo（a）的基因序列，并推导出氨基酸序列。结果提示了Apo（a）的分子结构与纤溶酶原极为相似。Apo（a）含有一个疏水信号序列，其后为37个Kingle-4拷贝、1个Kingle-5及1个胰蛋白酶样区。第36个Kingle-4含有一个额外未配对半胱氨酸，推测此处可能是Apo（a）以二硫键与ApoB结合的部位。经胰蛋白酶限制性水解Apo（a）发现，Apo（a）中的Kingle-4有75%～85%的氨基酸与颖溶酶原的第391～472个氨基酸相同，有共同的抗原簇，表现出两者有交叉反应。纤溶酶原（PG）是一种丝氨酸蛋白酶原，含有791个氨基酸残基。结构中含有5个富含半胱氨酸的“Kingle”样结构，即Kingle-5，在Kingle-5的后面为一丝氨酸蛋白酶区。PG与Apo（a）结构相似。

Kingle结构是三个二硫键组成的三套环形结构，含有78～82个氨基酸残基，在其第1与第6，第2与第4，第3与第5半胱氨酸上，连成三个二硫键。这种结构也出现在前凝血酶，尿激酶，链激酶和纤溶酶原激活剂（t-PA）的组份中。由于Apo（a）分子中的Kingle-4数目可在15-37之间变化，从而造成Apo（a）有多种不同的异构体。

Apo（a）结构中有一蛋白酶区，推测其功能可能是一种酶。另外在分子中相当于PG蛋白酶的丝氨酸被精氨酸代替，即可使其丧失酶的功能。由于Kingle结构与PG相似，推测Apo（a）可能结合到像PG受体或纤维蛋白那样的大分子上，再加上LP（a）颗粒携带的胆固醇结合到血管损伤部位，因此它不仅促进动脉粥样硬化形成，也阻碍血管内凝血块的溶解。

第六节　载脂蛋白D

ApoD是HDL中仅次于ApoAⅠ、AⅡ的一种载脂蛋白，在HDL₂中约占21%，HDL₃中占43%，VLDL中含有36%，ApoD化学本质是糖蛋白，其糖的组份中含有葡萄糖，甘露糖、半乳糖、葡萄胺和唾液酸。ApoD又称为薄线肽（thinline peptide），其分子量为22100，为一条多肽链，C-末端为天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸和丝氨酸，N-末端是封闭的，正常人血清含量为100～120mg/L。ApoD的生理功能尚不清楚，流行病学调查表明，ApoD与胆固醇酯尤其是HDL胆固醇之间存在着相关性，推测其可能是一种胆固醇转移蛋白，在胆固醇酯从HDL向VLDL的转移过程中起着重要的作用，也有不支持这一论点的实验依据，还有报道心肌梗塞和冠心病患者血浆ApoD水平与HDL-胆固醇水平呈正相关并同时降低。ApoD水平可能与遗传因素有关，并与ApoAⅠ共同作为心血管疾病的早期预测指标。

第七节　载脂蛋白H

人载脂蛋白H（human apolipoprotein H,ApoH）又称为β₂糖蛋白Ⅰ（β₂-glycoprotein,β₂-GI），由Schultze等于1961年首先发现，它是人血浆中作为过氯酸可溶性部分存在的一种50kD糖蛋白。

ApoH是由326个氨基酸残基组成的单链多肽，其中含量最丰富的是脯氨酸（共31个），半胱氨酸共有22个，与二硫键的形成有关。含有甘氨酸23个，并与胱氨酸共同形成高频β-转角所必需。ApoH分子量为50kD，具有寡聚多糖的结构，含有5个分支糖胺寡聚多糖侧链，糖链占整个蛋白质分子的19%，系由半乳糖，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖及N-乙酰神经氨酸组成。所有寡聚多糖均通过糖基受体序列Asn-X-Ser/Thr而连接到天冬酰胺位点上，分别位于143、164、169、174和234残基位置上。受体序列中间位的“X”为色氨酸（Trp），且这两个Trp在蛋白链中都为同源位点。

因等位基因缺失可引起血清浓度异常，依此提出两个常染色体共显性等位基因-Bg^N（正常型）和Bg^D（缺失型）控制ApoH的表达模式：Bg^NBg^N纯合子个体，其ApoH浓度在169～300mg/L；Bg^NBg^D杂合子，血清浓度在60～140mg/L；而Bg^DBg^D纯合子个体则＜50mg/L。Bg^D缺失型等位基因出现频率在先天愚型人群中＞20%，比健康人群要高。非遗传因素也可以起血清中ApoH含量的变化。因ApoH基因变异，其结构存在多态性，目前认为编码相关的三个普通等位基因即ApoH₁、ApoH₂和ApoH₃、还有ApoH₄的存在。三个常染色体的3个等位基因型决定了六种不同形式的表型，共同基因ApoH₂出现频率高达90%。

在人血浆中占总量60%的ApoH存在于离心后d＞1.21g/ml底层部分的游离脂蛋白中，余下部分则主要存在于富含TG的脂蛋白中，是CM、VLDL、LDL和HDL的组成成分，又是LPL的激活剂。有报道，ApoH在ApoCⅡ存在时，能提高LPL活性45±17%，而ApoCⅢ则降低ApoH是ApoCⅡ赋予的LPL活性的77%。ApoH还参与凝血机制，因为ApoH与血小板结合，使磷脂带阴电荷，从而减少凝血因子Xa、Va、Ca⁺⁺与凝血酶原的结合位点或凝血酶原结合到血小板膜上后，通过调节腺苷酸环化酶活性来抑制ADP介导的血小板凝集，它作为一种血浆抑制因子，抑制内源性凝血旁路的接触激活。

在肾小管疾病中，ApoH的检测可作为早期肾小管损伤时的诊断指标，然而灵敏度尚不够高。

健康人血浆中ApoH浓度为193±30mg/L。

(周新　郑芳)

（载脂蛋白的种类与结构）参考文献

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第四章　载脂蛋白基因结构及其基因型

自80年代初期以来，随着分子生物学技术的发展和应用，载脂蛋白（Apo）AⅠ、AⅡ、AⅣ、（a）、B、CⅠ、CⅡ、CⅢ、CⅣ、D、E、F、H以及J的cDNA和基因已先后分离和鉴定。这些载脂蛋白基因的染色体定位业已完成。载脂蛋白cDNA及基因的鉴定以及染色体定位为深入研究载脂蛋白的结构与功能、载脂蛋白基因的表达与调控以及载脂蛋白基因的遗传变异与动脉粥样硬化的关系提供了新的工具。已有大量文献报道了各种载脂蛋白基因的多态性。有些多态性与异常的脂蛋白代谢以及早发动脉粥样硬化密切相关。本章拟就各种载脂蛋白的基因结构及其基因型、载脂蛋白基因的染色体定位、载脂蛋白基因的多态性与动脉粥样硬化的关联作一简要介绍。

第一节　载脂蛋白基因结构

载脂蛋白基因的分离是通过用相应的cDNA作为探针筛选基因文库而完成的。比较基因的核苷酸序列与cDNA的核苷酸序列得以鉴定基因的内含子与外显子数目以及它们的分界线。大部分真核细胞的基因含有内含子，内含子不编码氨基酸，但有些内含子参与基因表达的调控。外显子通常占据基因内的三个区域：第一个区域不编码氨基酸，含有RNA转录起始以及导向mRNA至核糖体合成蛋白质的信号序列；第二个区域编码信号肽、前肽以及成熟蛋白质的部分氨基酸；第三个区域除编码成熟蛋白质的氨基酸外，还含有终止翻译以及添加聚腺苷酸的信号。并非每个基因所含的内含子与外显子数目相等。真核细胞基因的这些结构特点也体现在载脂蛋白的基因结构中。有些载脂蛋白基因具有独特的结构特征。本节重点介绍ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、E基因结构的类同性、载脂蛋白B基因的结构特点以及Apo（a）基因的结构特点。其他的载脂蛋白基因结构均以列表的形式介绍。

一、ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ及E的基因结构的类同性

载脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ以及E的基因结构非常相似。除ApoAⅣ缺少第1个内含子外，其余的载脂蛋白基因均由三个内含子与四个外显子组成（如图4-1所示）。内含子的分布位置几乎相同。第一个内含子截断5'未翻译区，第二个内含子截断信号肽的编码区，靠近信号肽的切割部位，第三个内含子截断编码成熟蛋白质的区域。尽管ApoAⅣ缺少第一个内含子，它的第二及第三内含子的分布与其他载脂蛋白相同。载脂蛋白AⅠ、AⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、E基因的前三个外显子以及ApoAⅣ基因的前二个外显子的长度颇为相近，它们之间长度的不同主要取决于第四个或第三个（ApoAⅣ）外显子的长短。这七种载脂蛋白基因结构的类同支持如下假说，即这些基因起源于一个共同的前体，通过部分或完全的基因重复的机制衍化而来。

图4-1 载脂蛋白AⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ以及E的基因结构示意图

宽方块代表外显子，细线代表内含子或5'及3'侧翼区。在外显子区内：两端的空方块代表5'及3'未翻译区；斜线方块代表信号肽区；位于信号肽与成熟肽之间的窄空方块代表前肽（Prosegment）区。图中的数值表示各个外显子的长度（核苷酸对的数目）。（源出：L.Chan,Klin.Wochenschr.67:227,1989）

二、载脂蛋白B的基因结构

与上述载脂蛋白基因的结构相比较，载脂蛋白B的基因结构具有显着的差异。后者长达43000核苷酸碱基对，含有28个内含子与29个外显子。其中外显子26与29分别长达7572与1906碱基对。外显子26编码载脂蛋白B的第1379至3903个氨基酸，它比迄今为止所发现的哺乳动物基因的任何外显子都长3倍之多。这种特长的外显子是否由一些短外显子融合所致尚不清楚。在载脂蛋白B的内含子中，已发现有6种重复DNA序列。其中某些特征序列模式已成为流行病学及家族研究的工具。

载脂蛋白B基因表达的产物有ApoB₁₀₀和ApoB₄₈，前者由4536个氨基酸组成，后者包含2152个氨基酸。载脂蛋白B₄₈是由小肠RNA剪切酶修饰ApoB信使RNA所产生的。小肠ApoB信使RNA在第6666个核苷酸的位置上含U，而肝ApoB信使RNA的同一位置上为C。由U取代C导致了一个终止翻译密码子（UAA）的产生。UAA取代了编码ApoB₁₀₀第2153个氨基酸谷氨酰胺的CAA密码子。故在小肠ApoB基因表达的产物ApoB₄₈仅含2152个氨基酸。约占ApoB₁₀₀组成的48%（见图4-2）。这种ApoB信使RNA剪切机制在哺乳动物的分子生物学研究领域内是空前未有的先例。这种机制的存在有何生理意义还待进一步的探讨。

图4-2 载脂蛋白B基因结构以及ApoB₁₀₀与ApoB₄₈合成示意图

载脂蛋白B基因的29个外显子均由竖线表示出来，其中两个特长的外显子26个和29作了特别的标记。位于外显子之间的28个间隙代表28个内含子。图中的碱基对数目分别代表载脂蛋白B基因、载脂蛋白B₁₀₀信使RNA以及ApoB₄₈信使RNA的长度。UAA和TAA为终止翻译密码子，CAA为编码谷氨酰胺的密码子。（源自Young S G Circulation82(5):1597,1990）

三、载脂蛋白（a）的基因结构

载脂蛋白（a）的基因由10～45个内含子和11～46个外显子组成（见图4-3A）。这种变异主要取决于Kringle（丹麦烤卷饼）-4功能区的数目，此数目可高达37。其中24个Kringle-4功能区核苷酸序列完全相同，均由342核苷酸碱基对组成。第24、27、28及29区仅相异于3个核苷酸。其他的区有11～71核苷酸序列的不同。Apo（a）基因的结构与血纤维蛋白溶酶原的基因结构相似（见图4-3A与图4-1B）。其中信号肽编码区100%的等同。其他区域的类似程度在75%～94%不等。这提示Apo（a）与血纤维蛋白溶酶原基因由同一个前体衍化而来。正是由于这个类同性，脂蛋白（a）不仅与脂类代谢有关。而且也参与血液凝固的机制。

图4-3 Apo（a）与血纤维蛋白溶酶原基因结构(A)与cDNR结构(B)的比较

在图4-3A中，数值Ⅰ-XIX标记的竖棒代表外显子的数目与序列。外显子间的间隙为内含子。在Apo（a）的基因结构中，n代表Kringle-4功能区的数目是变动的，可高达37。在图4-3B中，S代表信号肽：T代表“尾巴”区；Ⅰ-Ⅴ分别代表Kringle-5功能区；P代表蛋白酶功能区。血纤维蛋白溶酶原与Apo（a）各功能区的相似程度（%）标记在图B的下部。（源自：Ichinose A. Biochemistry31:3115,1992 and Mclean et al. Nature 330:136,1987.）

四、人体载脂蛋白基因结构一览表

表4-1列出所有已经鉴定的人体载脂蛋白的基因结构，即内含子与外显子的组成以及基因表达后的产物信号肽、前肽及成熟肽的分布。表中附有的文献索引供进一步查阅时参考。

表4-1 人体载脂蛋白基因的结构特征

*：尚未见有关资料报道。

第二节　载脂蛋白基因的染色体定位

大部分人体载脂蛋白基因的染色体定位采用了两种方法：DNA印迹法（Southern blotting）；荧光标记原位杂交法（fluorescence insitu hybridization）。DNA印迹法主要是分析从人与老鼠或中国苍鼠体细胞杂交体中提取的DNA。如果人体某种载脂蛋白cDNA或基因DNA探针仅与含有特定人体染色体的体细胞杂交体DNA杂交，且不与同一杂交体内非人体染色体DNA交叉反应，这种载脂蛋白基因的染色体定位便可初步确立。荧光标记原位杂交法使用荧光素标记的载脂蛋白DNA探针与固定的分裂中期的染色体杂交，这种方法可确立载脂蛋白基因在染色体上的特定位置。这种定位的准确性可用某个染色体特异性的中心粒探针杂交进行佐证。在已确立的人体载脂蛋白基因染色体定位中ApoAⅠ、CⅢ、及AⅣ在第11号染色体和ApoE、CⅠ及CⅡ在第19号染色体上的位置毗邻，而其他载脂蛋白基因的分布较分散。

一、载脂蛋白基因丛分布

人体载脂蛋白基因AⅠ、CⅢ和AⅣ在第11号染色体上的位置毗邻，它们分布在22000个核苷酸碱基对之内，排列顺序为AⅠ-CⅢ-AⅣ。AⅣ基因距AⅠ基因3'末端12000个碱基对。AⅣ的转录方向与AⅠ一致。CⅢ基因位于AⅠ和AⅣ之间。它的转录方向与AⅠ及AⅣ相反。ApoE、CⅠ和CⅡ的基因分布在第19号染体上，它们之间的距离仅为4000核苷酸碱基对。这三个基因以及6磷酸葡萄糖异构酶基因紧密相连地分布在中心体至长臂第13区段内。低密度脂蛋白受体的基因亦分布在第19号染色体，不过它分布在短臂区域内。这种载脂蛋白基因丛的分布可能反映这些载脂蛋白基因在进化的早期比较接近。它们的表达可能受着协同的调控机制。这种毗邻分布也具有临床意义。其中一种载脂蛋白基因的多态性也可能与其毗邻的载脂蛋白基因的多态性或遗传特征有关。

二、载脂蛋白基因染色体位一览表

表4-2列出载脂蛋白基因的染色体定位。大部分载脂蛋白基因在染色体长臂或短臂上的位置均已确定。表中列出的主要参考文献供进一步查阅其定位方法时参考。

表4-2 人体载脂蛋白基因的染色体定位

*：q代表长臂；数值代表区段；

**：p代表短臂；

***：尚未见有关资料报导；

****：参见计算机网络联系基因库(GDB:http:11www.gdb.orgl)；

1：ApoH也称为β2-糖蛋白Ⅰ(β2-glycoprotein Ⅰ)；

2:ApoJ也称为补体融解抑制剂(Complement lysis inhibitor,CLI),硫化糖蛋白2(Sulphatedglycoprotein2,SGP-2),gp-Ⅲ，SP-40，40，TRPM-2等。

第三节　载脂蛋白基因的多态性

在人类进化过程中，基因的DNA序列在逐渐演变。这种演变大都发生在氨基酸编码子以外的区域，称为“中性”变化，不导致临床疾病的发生。但是，基因的氨基酸编码区以及基因表达的调控区的DNA序列改变时有发生。导致蛋白质的合成量改变或基功能的异常。载脂蛋白结构基因或其调控区DNA序列的突变引起致高脂血症或早发动脉粥样硬化已大量见诸于医学文献。新的载脂蛋白基因的多态性不断地被发现。

检测载脂蛋白基因的遗传变异通常使用从外周血白细胞中提取的DNA为起始材料，通过聚合酶链反应扩增基因DNA的产量，嗣后，或采用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradientgel electrophoresis, DGGE）显示由基因编码胺基酸区DAN序列突变所致的单股DNA构象的多态性；或使用等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法（allele-specificoligonuc leotide hybridization，ASO）探测突变的等位基因；或测定限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）鉴定基因DNA序列的突变；或直接对某基因的片段进行DNA序列测定，与正常的相应的DNA序列比较，检测有否突变发生。这几种方法为较常使用的方法。有关这些方法的详细介绍可参见本书第十六章的生物化学检验技术篇。本节主要介绍ApoB，ApoE,Apo（a）。ApoAⅠ基因的多态性。对其他载脂蛋白基因的多态性仅以举例的方式略述。

一、ApoB基因的遗传变异与多态性

ApoB基因的遗传变异与多态性分以下几种类型进行介绍：①RFLP；②导致血浆胆固醇水平降低的基因突变；③导致血浆胆固醇升高的基因突变；④其他类型的多态性。

1．RFLP

据报道，载脂蛋白B基因的限制性片段长度多态性至少375种。后来发现有些多态性并非存在，纯属DNA序列测定错误。表4-3列举了10种RFLP。产生这些RFLP的突变或发生在ApoB基因上游启动子区域，或发生在内含子区域，或在外显子区域。

表4-3 ApoB基因限制性片段长度多态性举例

（源自：Young S G. Circulation 82:1583,1990）

表4-3所列发生在外显子内的突变，除XbaⅠ限制性片段长度多态性外，其余均导致氨基酸改变。已有很多研究者致力于研究常见的ApoB基因PFLP与高胆醇血症、高甘油三酯血症硬化的相关关系，但发现令人信服的相关关系的报道不是很多，还有的结果相互矛盾。正如Young指出的那样，有的研究所使用的样本量太小；有的研究对照组的选择不合规范；有的研究基于不同的种族，忽视了正常的种族差异。很显然。在以后的相关研究中，尽可能选用大样本量，合理的选择对照组，考虑不同种族的正常遗传变异无疑对确证某些ApoE基因的RFLP与脂蛋白代谢紊乱的特殊表型以及早发动脉粥样硬化的关联尤为重要。

2．导致血浆胆固醇水平降低的ApoB基因突变

经过许多实验室的努力，一些ApoB基因的无义突变或移码突变导致家族性密度脂蛋白血症均已鉴定（见表4-4）。

表4-4 ApoB基因突变导致短ApoB的合成

(源自：Kane ,J.P.,and Havel, R.J.In:The metalbolic and molecular bases of inherited disease,edited by Scriver, C.R.et al, Vol Ⅱ,p1868,1995,McGraw –Hill,Inc.,New York,U.S.A)

家族性低低密度脂蛋白血症的患者大多为杂合子，即他们携带一个正常的ApoB等位基因和一个变异的ApoB等位基因。纯合子以及复合杂合子患者少见。短ApoB合成的患者血浆中ApoB的浓度较低，仅为正常人ApoB等位基因产生的ApoB_-100浓度的2%～10%，其机理尚未完全明了。有人发现，含有ApoB₈₇和ApoB₈₉的LDL比含ApoB_-100的LDL更易于被LDL受体摄取。亦有人推测在杂合子患者中，由一个正常ApoB_-100等位基因编码的ApoB_-100与两个正常ApoE等位基因编码的ApoE组成的脂蛋白颗粒比正常的脂蛋白颗粒多含有1倍的ApoE，故前者易于被LDL摄取清除。这些均有助于解释一部分短ApoB合成患者体内低浓度血浆ApoB及低浓度血浆胆固醇的机制有等进一步努力。不难想到的是，家族性低低密度脂蛋白血症患者血浆中LDL胆固醇低，产生冠心病及动脉粥样硬化的危险性也降低。已有一些报道证实，这些患者不产生动脉粥样硬化且寿命增长。故有人认为，对惯常食用高饱和脂肪、高胆固醇饮食的北美人群，携带合成短ApoB的突变基因非但无害，反而有益于健康。

3．导致血浆胆固醇升高的基因突变。

Brown和Goldstein的经典研究，即LDL受体基因的突变，引起LDL清除障碍，LDL在血浆中蓄积，导致早发动脉粥样硬化，这是家族性高胆固醇血症的主要病因。这些患者的血浆总胆固醇浓度高于7.76mmol/L。然而有相当一部分人的血浆胆固醇浓度在6.47～7.76mmol/L之间，与正常人相比为轻中度升高。长期以来，人们一直推测ApoB基因遗传变异可合成有缺损的ApoB蛋白质，后者与LDL受体亲和力下降，引起LDL清除障碍，LDL在血浆中蓄积。这种推测于1989年得到了证实。Soria等人发现了家族性ApoB₁₀₀缺损。这些病人在其Apob cDNA第10708个核苷酸位置上，G转换成了A，导致ApoB₁₀₀的等3500个氨基酸精氨酸变换成了谷氨酰胺。这一突变使其LDL与LDL受体的结合力下降，产生高胆固醇血症。据估计，这种突变在人群中的发生率与LDL受体的突变率接近，即1/500。

另一家族性ApoB₁₀₀缺损是由ApoB基因第10800核苷酸位置上的C转换成T所致。这一突变ApoB内第3531个氨基酸精氨酸变成了半胱胺酸。8个患者的平均血浆LDL胆固醇水平在6.78mmol/L，而8个未患ApoB基因突变的亲戚为3.88mmol/L。患者LDL对LDL受体的亲和力仅为正常对照组的39%。由于C至T的转换，产生一个新的限制性内切酶切割部位（NsiI）,这将有助于在大范围人群内检测这种突变发生率。

4．其他类型的多态型

距ApoB基因3'末端500个核苷酸碱基对区域，有一DNA片段构成可变动数目的半联重复（variable number of tandem repeats. VNTR）已发现ApoB基因3'末端这种VNTR所致的多态性与心肌梗塞的发作有关联。

ApoB信号肽由27个氨基酸组成。在高加索种族人群中发现了两种多态性：一种为插入等位基因型，编码27个氨基酸；另一种为缺失等位基因型，编码24个氨基酸。Visvikis 等人发现缺失等位基因型与高血浆ApoB 水平、LDL胆固醇水平、LP（a）水平以及总胆固醇水平有关。最近Kammerer等人在34家共686名美籍墨西哥人中发现编码ApoB信号肽的三种等位基因：SP-24，SP-27，SP-29，它们分别编码24，27与29肽。携带SP-24等位基因的纯合子其血浆ApoB与LDL胆固醇的浓度显著高于SP-27纯合子。SP-29杂合子的ApoB与LDL胆固醇水平比SP-24纯合子还高。

二、ApoE基因的多态性

ApoE在胆固醇与甘油三酯代谢中起着重要作用。在正常人群中，10%以上的个体间血浆胆固醇水平的着异可归究于ApoE基因的多态性。主要的ApoE等位基因有ApoE2、ApoE3和ApoE4。ApoE3在人群中的出现率最高，被认为较常见的ApoE基因。ApoE2与Ⅲ型高脂蛋白血症相关，而ApoE4在老年性痴呆病（Alzheimer's disease）患者中的出现率较高。这后一发现开拓了人们的视野，即ApoE不仅在脂类代谢中至关重要，而且在其他的代谢过程中也扮演重要角色。已有报道，ApoE参与组织损伤的修复、免疫调节以及调控细胞生长与分化。相信随着时间推移，更多新的ApoE功能及新的ApoE基因多态性会被发现。

表4-5列举了一些已鉴定的ApoE基因的遗传变异。表中同时列出了密码子及其编码的氨基酸的改变、特定ApoE基因变异型首先被鉴定出的那个民族、出现频率、相关的高脂血症型以及遗传方式。

表4-5 ApoE多态性

多态性名称1	变异密码　子	核苷酸改变	氨基酸改变2	种族背景	分布率3		高脂血症型4	遗传方式
常见的ApoE基因型
	-	-	-	所有民族		41.9～91.1%	-
ApoE4	112	TGC→CGC	Cys→Arg	所有民族		6.4%～36.8%	N/HC
ApoE2	158	CGC→TGC	Arg→Cys	大部分民族		0.0%～14.5%	N/FD	陷性
与FD相关的多态型
ApoE0	第3内含子	A →G,G缺	合成两种短肽	美洲黑人		14	FD	陷性
3592bp-60	失移码突变	合成60肽	德国人		3	FD	陷性
ApoE4-费城	13	GAG →AAG	Glu →Lys	拉丁美洲人		7	FD	陷性
145	CGT →TGT	Arg →Cys	拉丁美洲人				陷性
ApoE3-Leiden	112	TGC →CGC	Cys →Arg	荷兰人		>40	FD	显性
	21bp重复	7个氨基酸患联重复
ApoE1	127	GGC→GAC	Gly→Asp	高加索人		>25	FD	未知
158	CGC→TGC	Arg→Cys
ApoE2-Christchurch	136	CGC→AGC	Arg→Ser	未报道		3	FD	未知
ApoE3	112	TGC→CGC	Cys→Arg	拉丁美洲人		6	FD	显性
142	CGC→TGC	Arg→Cys
ApoE3--kochi	145	CGT→TGT	Arg→His	日本人		4	FD	未知
ApoE2	145	CGT→TGT	Arg→His	未报道		3	FD	未知
ApoE1- Harrisburg	146	AAG→GAG	Lys→Glu	日本人高加索 人		8	FD	未知
ApoE2	146	AAG→GAG	Lys→Gln	荷兰人美国人		>40	FD	显性
ApoE3华盛顿	210	TGG→TAG	Trp→终止密码	美国白人		3	FD	陷性
ApoE2 Fukuoka	224	CGG→CAG	Arg→Gln	日本人		1	FD	未知
与非FD高脂血症相关的多态型
ApoE5	3	GAG→AAG	Glu→Lys	日本人		0.5%	HC
13	GAG→AAG	Glu→Lys	法籍加拿大人		6	HC/HTG
ApoE2-Dunedin	228	CGC→TGC	Arg→Cys	未报道		2	HTG
ApoE2	236	GTG→GAG	Val→Glu	荷兰人		8	HTG
ApoE7-Suita	244	GAG→AAG	Glu→Lys	日本人		0.5%～0.8%	HC/HTG
245	GAG→AAG	Glu→Cys
ApoE3	112	TGC→CGC	Cys→Arg	荷兰人		3	HTG
251	CGC→GGC	Arg→Gly
ApoE1	158	CGC→TGC	Arg→Cys	荷兰人		2	HC
252	CTG→GAG	Leu→Glu
与高脂血症无关的多态型
ApoE4-+-Ferburg	28	CTG→CCG	Leu→Pro	德国高加索人		0.4%～0.9%	N
112	TGC→CGC	Cys→Arg
ApoE4	112	TGC→CGC	Cys→Arg	荷兰人		5	N
274	CGC→CAC	Arg→His
ApoE4+	296	AGC→CGC	Ser→Arg	荷兰人		5	N
ApoE5	84	CCG→CGG	Pro→Arg	美国白人		0.2%	N
112	TGC→CGC	Cys→Arg
ApoE3-Freibaug	42	ACA→GCA	Thr→Ala	德国高加索人		1	N
ApoE3	99	GCG→ACG	Ala→Thr	美国人		1	N
152	GCC→CCC	Ara→Pro
ApoE2	134	CGG→CAG	Arg→Gln	荷兰人		5	N

1．除费城（Philadelphia）与华盛顿（Washington）两地名外，其他的地名均未翻译过来；

2．氨基酸代号：Cys-半胱氨酸；Arg-精氨酸；Glu-谷氨酸；Lys-赖氨酸；Gly-甘氨酸；Asp-天门冬氨酸；Ser-丝氨酸；His-组氨酸；Gln-谷氨酰胺；Trp-色氨酸；Val-缬氨酸；Leu-亮氨酸；Thr-苏氨酸；Ala-丙氨酸；Pro-脯氨酸；

3：分布率：加百分号的分布率是根据检测1000人以上的结果计算的；未加百分号的数值代表测出的携带ApoE多态型（包括纯合子与杂合子）的人数；

4：缩写：N（Normal,正常）HC（hypercholesterolemia，高胆固醇血症）；FD（familialdysbetalipoproteinemia,家族性异常低密度酯蛋白血症，含Ⅲ型高脂蛋白血症）。

（源自：Knijff et al. Hum. Mutation4:181,1994）

三、Apo（a）基因的多态性

血浆Lp（a）的浓度与Apo（a）蛋白质的大小成反比，即Apo（a）的分子量愈大，则Lp（a）的浓度愈低；Apo（a）的分子量愈小，则Lp（a）的浓度愈高。Apo（a）的分子量在400～800KDa之间。按照Apo（a）在聚丙烯凝胶电脉时相对于ApoB₁₀₀（分子量为520KDa）的迁移率，Utermann等人于1987年将Apo（a）归类为六种多态型；F比ApoB₁₀₀迁移快；B与ApoB₁₀₀迁移率相等；S₁，S₂，S₃，S₄比ApoB₁₀₀迁移慢。现已证实。Apo（a）蛋白质的多态型是由Apo（a）基因中Kringle-4的数目变化而引起的。Kring-4基因片段含有几个稀少的限制性酶切部位（NotI,SfiI.KspI,Sval,KpnI），这为加速筛选Apo（a）基因的多态性提供了帮助。表4-5列举在奥地利北部Tyrolean区高加索人群中用KpnI作工具所测得的RFLP与1-4Kringe的数目、Apo（a）蛋白质的大小以及血浆Lp（a）浓度的关系。

表4-6 Apo（a）Kpni 片段与Apo（a）蛋白质多态型、Kringle-4功能区数目以及血浆Lp（a）浓度之关系

*:样本量太小,资料缺如。(源自：Utermann,G.In:The metabolic andmolecular bases of inherited disease.7th ed, Vol.Ⅱ,eds.Scriver,C.R.etal.p1897,McGraw-Hill.Inc.,New York,1995)

由表4-6可看出，血浆Lp（a）的浓度亦与Kpn片段的大小成反比。这为血浆Lp（a）与Apo（a）多态型的大小成反比从基因DNA水平提供了直接的证据。

Scana等人在Kringle-4第37个重复区（KIV-37，又称为KringleⅣ-10）检测出了两种突变：一种突变导致第72个氨基酸被精氨酸取代；另一种突变导致第66个氨基酸苏氨酸被蛋氨酸取代。前者致使其Lp（a）不能与赖氨酸结合，且血浆Lp（a）浓度降低。后者似乎与Lp（a）浓度无关。Mooser等人报道在距第1第外显子5’端1.3Kb区或内，由5个核苷酸[（TTT-TA）_n]构成的VNTR与其血浆Lp（a）浓度相关。此外。亦有报道Apo（a）基因5’端侧翼区DNA序列的多态性控制血浆Lp（a）的浓度。

四、ApoAⅠ基因的多态性

ApoAⅠ为HDL的主要结构蛋白。ApoAI基因突变可导致异常的ApoAⅠ蛋白质的合成。有些异常的ApoAⅠ影响HDL的代谢。已报道的阻碍ApoAⅠ合成的基因突变有重排、缺失、无义突变等方式。这些突变的纯合子患者表现出极低HDL胆固醇水平和早发冠心病。目前已发现至少有20种不同的ApoAI结构基因的点突变导致氨基酸转换（见表4-7）。其中两种突变（精氨酸173→半胱氨酸和脯氨酸165→精氨酸）与低HDL胆固醇水平相关，但并不引致早发冠心病。

Talmud等人发现ApoAⅠ基因启动子区域内距转录起始部位第75个碱基（-75bp）A置换G的突变与高ApoAI及HDL水平相关。这种突变后的等位基因称为A等位基因，而含G的称为G等位基因。Saha等报道A等位基因在新加坡华人中出现的频率（0.27）高于高加索人(0.12)。Wang等人发现，ApoAⅠ基因第1内含子5'末端，第83碱基C转换成T或第84碱基G转换成A，致使MspI酶切点丧失，这种突变与高HDL胆固醇相关，比上述的-75碱基A置换G突变与高HDL胆固醇的相关还强。

表4－7　人体ApoAI基因点突变导致氨基酸改变

1：氨基酸代号可参见表4-5脚注；第1排氨基酸右上角的数值表示其在ApoAⅠ一级结构上的位置；2：加底线的核苷酸为点突变部位。（源自：Eckardstein et al.J.Biol Chem.265:8612,1990）

五、其他载脂蛋白基因的多态性

与以上介绍的ApoB、ApoE、Apo（a）以及ApoAI的基因一样，其他载脂蛋白的基因也存在多态性，以下简要地列举一些例子。

1．ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因限制性片段长度多态性

在ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛内，使用XmnⅠ、ApaⅠ、MspⅠ、PstⅠ、SstⅠ、XbaⅠ、TaqⅠ和PvuⅡ限制性内切酶已检测出10多种RFLP。尽管这些多态性大多由编码氨基酸以外的DNA序列突变所致,其中有些RFLP的携带者与增加冠心病的危险相关。比如用限制性内切酶PstⅠ消化从人群中搜集的DNA后。用ApoAⅠcDNA探针印迹DNA可测得3.3Kb的DNA片段（称为P₂等位基因）与2.2Kb的DNA片段（称为P₁等位基因）。P₁等位基因在正常人群中出现率较高。P₂等位基因在低HDL胆固醇患者中的出现率高于对照组的6倍。来自英国与美国的报道亦证实，杂合子P₁P₂携带者血浆ApoAⅠ与HDL胆固醇的水平显著地低于P₁P₂基因型携带者。这提示在ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛中，PstⅠ酶切点的多态性，P₂等位基因，与降低血浆ApoAⅠ和HDL的水平以及诱发冠心病有关。最近，Dallinga-Thie等人在美国脂类研究杂志上报道，用限制性内切酶XmnⅠ与MspⅠ在ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛内检测出的稀有等位基因与高血浆胆固醇、甘油三酯、ApoB以及LDL胆固醇水平相连。这些结果显示，ApoAⅠ-CⅢ-AⅣ基因丛参与调节血浆胆固醇及甘油三酯的代谢。

2．ApoEⅠ-CⅠ-CⅡ基因限制性片段长度多态性

位于第19对染色体上的ApoEⅠ-CⅠ-CⅡ基因丛也有多态性的存在。检测出其RFLP的限制性内切酶包括：HpaⅠ、TaqⅠ、BglⅡ、DraⅠ、NcoⅠ以及BglⅡ。Klasen等人报道，HpaⅠ限制性片段长度的多态性与易发Ⅲ型高脂血症有关。然而HpaⅠ限制性片段长度的多态性与E₂/E₂基因型无关接关联。这说明HpaⅠ的RFLP是不同于ApoE基因的一种独立的遗传因子，其突变点尚未阐明。

3．ApoAⅡ基因的突变

Deeb等报道了在一对日本姐妹中检测出的家族性ApoAⅡ缺陷症。冠状动脉造影显示这对姐妹未患血管疾病。尽管免疫生化检验测不出血浆ApoAⅡ水平，患者HDL胆固醇在正常范围。DNA分析显示，患者ApoAⅡ基因内第3内含子剪接供体部位的第一个碱基G突变成为A，从而阻碍了内含子从初级转录物中剪除掉的过程。这无疑是导致ApoAⅡ缺陷的原因。

4．ApoAⅣ基因的多态性

常见的ApoAⅣ等位基因编码ApoAⅣ的第360与347个氨基酸，分别为谷氨酰胺和苏氨酸。当ApoAⅣ基因的第360密码子上第3个碱基T置换G后，正常的第360氨基酸位置上的谷氨酰胺被代之为组氨酸，当第347密码子上第1个碱基T置换A后，苏氨酸₃₄₇→丝氨酸的变异即发生。关于这两种ApoAⅣ基因多态性对脂类代谢的影响尚无一致的结论。另一种突变，即密码子127的突变可致HincⅡ酶切位点的丧失。最近Kamboh等人对西伯利亚中部的驯鹿牧民检测中发现，没有HincⅡ酶切位点等位基因的携带者血浆甘油三酯水平高于HincⅡ酶切位点等位基因的携带者。

5．ApoCⅡ基因的多态性

载脂蛋白CⅡ基因的突变有四种类型被鉴定：a.无义突变；b.起动密码子的碱基突变；c.第2内含子剪切供体部位突变；d.由碱基插入或缺失所致的移码突变。这些突变患者的血浆ApoCⅡ水平显著降低或缺失。其遗传方式为常染色体隐性遗传。

6．ApoCⅢ基因的多态性

已发现有三种ApoCⅢ基因多态性与高甘油三酯血症有关：a.3175核苷酸C颠换成G；b.3206核苷酸T颠换成G；c.3206G等位基因。Li等人不久前在临床研究杂志上报道，ApoCⅢ基因启动子内-482与-455碱基的突变与发生高甘油三酯血症有关。作者推测这种突变正发生在受胰岛素抑制DNA序列范围内。突变后的ApoCⅢ基因启动子摆脱了胰岛素的抑制调控，ApoCⅢ的转录大大加强，ApoCⅢ的合成增加。这可能是人群中发生高甘油三酯的一个主要因素。

7．ApoD基因的多态性

Vijayaraghavan等人检测了57个肥胖病人57名对照者ApoD基因TaqⅠ酶切位点限制性片段长度多态性：2.2与2.7Kb等位基因。他们发现2.2Kb等位基因在肥胖者中的分布显著地高于正常者。这包括含有2.2Kb等位基因的杂合子与纯合子，提示显性遗传方式。作者认为，ApoD基因TaqⅠ限制性片段长度多态性可作为研究肥胖病的一个遗传标志。

8．ApoH基因的多态性

ApoH基因第247密码子突变，致使第247个氨基酸缬氨酸被亮氨酸取代。因为此突变使RasⅠ酶切位点丧失，故这种限制性片段长度多态性很易检测。最近Kamboh等调查西伯利亚中部驯鹿牧民中三种ApoH等位基因ApoH1、ApoH2、与ApoH3的分布与血浆脂质水平的关系，他们发现ApoH等位基因与男子低甘油三酯水平相关。而与女子高甘油三酯水平相关。而女子高甘油三酯水平相关。ApoH基因的多态性与脂质代谢的关系还有待于更广泛地、更深入地探讨。

9．ApoJ基因的多态性

Kamboh暨同事报道，在对美国白种人、黑人、美洲印第安人、爱斯基摩人、新几内亚人及尼日利亚人6个民族共985名受试者的检测中。他们发现了ApoJ有三种多态型，即ApoJ1、ApoJ2和ApoJ3。ApoJ1存在于所有受试者基因内。ApoJ2仅存于美国黑人与尼日利亚人黑人，出现频率分别为24%与28%。ApoJ3仅从一美国黑人受试者测出。造成此多态性的突变尚未见报道。这三种“等位基因”似乎对总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇、VLDL胆固醇、甘油三酯的水平没有显著的影响。

结论

随着分子生物学技术应用于脂类代谢与动脉粥样硬化的研究领域，几乎所有被命名的载脂蛋白的cDNA与基因被分离与鉴定。有关载脂蛋白基因多态性的报道与日俱增。人们对脂蛋白代谢紊乱从分子缺陷的水平进行认识取得了长足的进展。然而，各种载脂蛋白的生理功用尚未完全阐明。近年来发现ApoE4与老年性痴呆有关，揭示了ApoE的新的功用就佐证了这一点。对各种载脂蛋白的基因的各种多态性在所有种族间的分布进行系统的检测与分析还有待于进一步努力。一些新的、简易的、准确的检测方法也有待于开发。这些研究可望为载脂蛋白与动脉粥样硬化发病机制的探讨以及对动脉粥样硬化与冠心病的防治寻求新的措施开拓新的前景。

（叶永清）

（载脂蛋白基因结构及其基因型）参考文献

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第五章　脂类代谢有关酶类

参与脂质代谢的酶有许多种，其中关键酶有LPL、HTGL、ACAT、HMGCoA还原酶，HMGCoA合成酶。

第一节　脂蛋白脂肪酶

脂蛋白脂肪酶（liportein lipase, LPL）是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞，乳腺细胞以及巨噬细胞等实质细胞合成和分泌的一种糖蛋白，分子量为60kD，含3%～8%碳水化合物。活性LPL以同源二聚体形式存在，通过静电引力与毛细血管内皮细胞表面的多聚糖结合，肝素可以促进此结合形式的LPL释放入血，并可提高其活性。LPL生理功能是催化CM和VLDL核心的TG分解为脂肪酸和单酸甘油酯，以供组织氧化供能和贮存；LPL还参与VLDL和HDL之间的载脂蛋白和磷脂的转换，ApoC-Ⅱ为其必需的辅因子，其中的C端第61～79位氨基酸具有激活LPL的能力。

一、LPL结构与合成

比较不同种类包括人类脂肪组织、牛乳腺、鼠巨噬细胞、猪脂肪组织和禽类的LPL一级结构，发现人类LPL氨基酸序列与哺乳类动物有87%～94%同源性，与禽类比较也有70%同源性，表明LPL在进化过程中的高度保守性。人类LPL、肝脂酶（HL）以及胰脂酶（PL）具有高度相似的氨基酸序列，推测三者可能起源于同一个基因家族，具有共同的作用机制。

目前人类LPL二级结构尚未阐明，推测LPL分子可能由两个结构区域构成：N端区的和C端区，N端区包括1～315位氨基酸，形成一个以β折叠为主的近球形结构，它是LPL重要的功能区，催化活性中心就位于此区。构成LPL催化活性中心的三个氨基酸分别为Ser¹³²、His²⁴¹和Asp¹⁵⁶，用中性氨基酸取代活性中心附近的氨基酸，LPL活性明显下降或消失。Asn⁴³是N端区一重要的糖基化位点，它起着维持LPL正常三维结构的作用。对正常分泌的LPL活性功能具有重要意义。此外，N端区第279～282位和292～309位氨基酸介导LPL与肝素结构。C端区呈一个折叠的柱状连接在球形的N端区，C端区的功能尚有争议，多数认为与介导酶与底物接触，形成活性的LPL同源二聚体以及间接参与酶解过程。

LPL在实质细胞的粗面内质网合成，新合成的LPL留在核周围内质网，属于无活性酶，由mRNA翻译合成的无活性LPL，称为酶前体，再糖基化后，才转化成活性LPL酶，如图5-1所示。从细胞中如何分泌；目前认为有两种机制，其一是细胞合成的LPL后直接分泌，不贮存于细胞内，即称为基本型分泌；其二是调节型分泌，某些细胞新合成LPL贮存于分泌管内，一旦细胞受到一个合适的促分泌剌激。LDL即分泌，此时分泌往往大于合成。所有细胞都具备基本型分泌，只有少部分细胞兼有两种分泌形式。Vannier提出，LPL是结合在插入细胞内分泌器并存在于细胞膜外表面的硫酸肝素糖蛋白（heparin sulphate protoglycans, HSPG），致使酶保持一种无活力的浓缩状态，然后通过一个尚未阐明的机制由肝素促使分泌，即肝素后血浆中得到活化的LPL，分布在含甘油三酯的脂蛋白中，并主要是分解CM和VLDL的甘油三酯并结合附着在这些脂蛋白残粒中，可能形成肝摄取这些颗粒的信号。

图5-1 LPL的合成

二、LPL基因及其多态性

LPL基因位于8P22，长约35kb，由10个外显子和9个内含子组成，编码475个氨基酸的蛋白质，包括27个氨基酸残基的信号肽。现已查明外显子1长273kp，编码5'端非翻译区和信号肽区。外显子2～5长度分别为161、180、112和234bp，其中外显子2所编码的Asn⁴³糖基化位点为LPL催化活性必需的，外显子4编码脂质结合区。外显子6包含243bp。编码肝素结合区。外显子7～9长度分别为121、183和105bp。编码结构参与与ApoCⅡ结合。外显子10是LPL基因中最大的外显子，长1950bp，编码整个3'端非翻译区。LPL内含子7第序列尚未弄清，报道其中存在Alu重复序列和多态位点。Jurke等研究发现LPL内含子7中有一完整的Alu序列，长282bp，位于内含子7第1027～746位。Delin报道内含子6中也存在Alu序列。Alu序列在人类基因组中约占3%-6%，推测其功能与基因转录的调节，hnRNA的加工以及DNA复制的启动有关，并且是基因重排的热点位置。利用限制性片段长度多态性（RFLP_S）技术检测出LPL基因位点存在多态性，主要分布在LPL基因内含子和侧翼序列中，其中内含子6中的PvuⅡ多态位点（图5-2）和内含子8中的HindⅢ（图5-3）多态位点与高脂血症有关，这为高脂血症的家系连锁分析提供遗传标记。LPL基因转录起始点上游730bp区域是转录因子结合部位，5'侧翼区一27位有“TATA”框，是LPL基因启动子所在部位。

图5-2　LPLPvuⅡ-RFLP

M：DNA marder

1:DNA-PCR产物（319bp）

2-6：分别为P⁺P⁺、P⁺P^-、P⁺P^-、P^-P^-、P^--、P⁺P⁺、H⁺H⁺基因型

图5-3 LPL HindⅢ-RFLP

M:DNA marker

1～4:分别为H^-H^-、H^-H⁺、H⁺H⁺、H⁺H^-基因型

三、LPL与Ⅰ型高脂血症

Ⅰ型高脂血症为常染色体隐性遗传病，具有家族性。主要临床症状为阵发性腹痛，疹状皮肤黄色瘤和肝脾肿大，生化特征为含高甘油三酯的乳糜微粒在因浆中大量堆积，脂肪耐量显着异常，LPL活性下降，这种患者体内的LPL含量可能完全缺陷，用目前的检测方法测不出LPL存在，也不可能在肝素注射后使血浆LPL活性下降，推测可能是一种异常LPL翻译后修饰所致。

引起Ⅰ型高脂血症常见的LPL基因突变有三类：一是碱基置换突变。按性质又可分为错义突变和无意义突变，错义突变是指基因结构中某个碱基为另一个碱基取代，导致蛋白质分子中相应位置氨基酸改变，这类突变多集中在LPL活性中心所在的N端区，如Gly¹⁴²、Ala¹⁷⁶、Gly¹⁸⁸、IIe¹⁹⁴、Leu²⁰⁷、Arg²⁴³等，这些氨基酸被取代则LPL活性显著降低；无意义突变是指基因编码区发生突变后形成终止密码子，使翻译过程提前终止；导致合成肽链变短，Ⅰ型高脂血症发生与此类突变位点有关，若突变位点在第106位氨基酸的编码基因上，产生出来的短肽链产物不具有LPL催化功能，导致Ⅰ型高脂血症发生；突变位点在第447位氨基酸的编码基因（Ser⁴⁴⁷-Thr），其产物C端缺失2个氨基酸，不影响LPL活性：二是移码突变。是指在DNA分子中插入或缺失一个或几个核苷酸（但不是3个或3的倍数）造成这一位置以后的一列编码发生移位错误的突变，这种突变有的会生成终止密码而使翻译过程提前终止。有报道1例Ⅰ型高脂血症患者，其G⁹¹⁶位碱基发生缺失，产生一个提前终止码，利用Northern印迹技术未检测到可测水平的LPLmRNA，推测此移码突变可能导致LPLmRNA稳定性下降；三是基因重排。表现为大片段缺失或插入，目前发现外显子6中2kb插入，外显子9中3kb缺失，均导致I型高脂血症。

近年研究发现，1例Ⅰ型高脂血症患者脂肪组织中存在正常活性的LPL，肝素后的血浆中检测不出LPL存在，分析其脂肪组织中LPL化学组成，发现这种LPL的寡糖链含有较高水平的果糖，影响了LPL细胞内外的转运，提示翻译后的修饰异常也可影响LPL活性发挥。

脂蛋白脂肪酶基因突变点如表5-1所示。

表5-1 脂蛋白脂肪酶基因突变

第二节　肝脂酶

Hahn最早观察到，对患高脂血病的狗进行静脉注射肝素，即引起患狗混浊的血浆变清，这是由于一种具有脂解活性的酶从组织的肝素结合位点上释放到血液中所致。据此推测，这种脂酶是结合在细胞表面作为肝素受体的蛋白多糖，肝素竞争性地结合到细胞表面的蛋白多糖分子后。脂酶被置换下来进入血液中，把引起血浆混浊的酯类物质水解，于是血浆由混浊而变清。后来通过Sepharose-肝素亲和柱层析纯化，可从人的注射肝素后的血浆中得到两种不同的脂酶，一种被0.6～0.8mol/l NaCl液洗脱，不被高离子强度溶液抑制，不需要血浆辅助因子活化，肝脏切除动物的肝素灌注血浆中则不存在，因此，将此酶称之为肝脂酶（hepatic lipase,HL），此酶与早年Hahn观察到的脂酶是一致的。另一种被1.2～1.5mol/l NaCl液洗脱的部分则具有LPL的性质。

肝脂酶 （hepatic endothelail lipase, HL或HTGL）是肝素化血浆中存在的另一种脂酶，属于与血液循环中内源性TG代谢有关的酶之一。与LPL在功能上有相似之处，然而却是两种不同性质的酶，其特点是：①HL活性不需要ApoC-Ⅱ作为激活剂；②SDS可抑制HL活性，而不受高盐及鱼精蛋白抑制；③主要作用于小颗粒脂蛋白，如VLDL残粒，HDL同时又调节胆固醇从周围组织转运到肝，使肝内的VLDL转化为LDL。经人及鼠cDNA克隆的DNA序列探明HLcDNA编码。HL是共有2个N连接多聚糖链的糖蛋白，含有499个氨基酸残基，分子量53kDa，基因位于第15号染色体上，有合成氨基酸残基信号肽和476氨基酸残基的成熟肽的密码。与分解代谢有关的丝氨酸位于145位。LPL和HL的基因同属一组基因族，在进化上较为保守。HL、LPL和胰脂酶（pancereaticlipase,PL）的性质有相似之处，也有不同点，如表5-2所示。

表5-2 LPL、HL和PL的异同点

HL是肝实质细胞中合成，在合成过程中，酶蛋白的糖化及紧随着的低聚糖化修饰过程是分泌HL必要条件。免疫电镜观察到HL位于肝窦状隙内皮细胞表面，在肝素化后，HL可释放到血浆，激素可调节HL的释放，主要是类固醇激素，如雄性激素可升高HL酶活性，而雌性激素则相反。当怀孕或泌乳时，肝素后血浆中HL活力与血浆的游离胆固醇或类固醇呈负相关，肾上腺素抑制HL酶活性，另外胰岛素和甲状腺素在控制HL活力也亦有作用。

第三节　卵磷脂胆固醇酯酰转移酶

卵磷脂胆固醇酯酰转移酶（lecihin:cholesterolacyl transferase,LCAT）由肝脏合成释放入血液中，是一种在血浆中起催化作用的酶，其作用是将HDL的卵磷脂的C₂位不饱和脂肪酸转移给游离胆固醇，生成溶血卵磷脂和胆固醇脂。血浆胆固醇中几乎70%～80%是胆固醇酯，均是LCAT催化生成所致。LACT常与HDL结合在一起，在HDL颗粒表面活性很高并起催化作用，对VLDL和LDL的颗粒几乎不起作用。在人工基质中添加ApoA-Ⅰ，促使LCAT的活性升高。LCAT在磷脂代谢中起重要的作用。

LCAT由416个氨基酸组成。分子量为6.3kDa,属糖蛋白。糖蛋白，糖链约占24%，是维持其活性必不可少的组分。富含Glu、Gly、Pro和Leu。每一酶分子含Cys，其中两个连成二硫键。根据与胰脂酶序列的同源性比较，推测六肽：I178-G-J-S-L-G₁₈₃可能是酶的活性中心。LCAT中蛋白质α螺旋、β-折叠和其他的结构分别占21%、24%和55%。LCAt mRNA约为1400bp组成，其信号肽是440个氨酸组成的密码子。

LCAT由肝脏合成并分泌至血浆，以游离或与脂蛋白结合的形式存在。LCAT选择性底物是HDL，特别是新生盘状或小球形HDL₃。HDL核心是LCAT酶反应产物胆固醇的贮存库，并通过胆固醇酯转移蛋白将CE转移至其他脂蛋白和细胞膜，并与其交换。

LCAT除细胞合成外，在小肠、脾、胰、胎盘、肾上腺等组织发现有LCAT的mRNA，推测也可合成LCAT。LCAT基因定位于16q²²。全长约4600kb，由6个内函子组成。

第四节　HMGCoA还原酶

HMGCoA还原酶（HMGCoa reductase）是胆固醇合成的限速酶，存在于小胞体膜，催化合成甲基二羟戊酸（mevalonic acid），并生成体内多种代谢产物，称之为甲基二羟戊酸途径。细胞内胆固醇水平调节主要信赖于内因性胆固醇合成途径和LDL受体摄取细胞外胆固醇的外因途径两条。Goldstein ,Brown阐明其抑制机制认为，细胞内ch作为HMGCoA还原酶抑制剂使其活性降低，肝细胞膜上的LDL受体增加，从血中摄取ch增加，使血中胆固醇水平降低，设想HMGCoA还原酶活性降低的药物可使血中胆固醇水平下降，尤其是对FH的杂合子患者，LDL受体数锐减者可起治疗作用。

Kovanen等报导以merinolin的HMGCoA还原酶抑制剂投入，使狗血中LDL消失速度上升，LDL产生速度下降，肝移植的小儿FH纯合子患者，用梅维诺林治疗可使LDL胆固醇降低40%，而LDL产生速度下降35%，LDL合成减少的机制，有两种可能，一是胆固醇合成减少使VLDL生成量降低；第二是HMGCoA还原酶抑制剂使VLDL残粒或βVLDL异化增加，转变成LDL减少，体外实验也证实，从VLDL残粒到LDL的速度比正常状态下小20倍，与此同时LDL受体的亲和力也增加。

仓鼠HMGCoA还原酶基因长30kb，由20个外显子组成，在启动子5'端富含GC碱基。HMGCoA还原酶，从转录水平作为胆固醇代谢的调节点，与LDL受体基因启动子，HMGCoA合成酶，从转录调节域存在有相同的碱基系列，即CACCCC（或GT）AC的胆固醇调节元件（sterol regulatory element,SRE）存在，如图5-5所示。

图5-5 胆固醇代谢调节的启动子与SRE

第一条线的数字为从转录开始的距离（碱基对数）

（董学梅）

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第六章　脂蛋白受体

脂类在血液中以脂蛋白形式进行运送。并可与细胞膜上存在的特异受体相结合，摄取进入细胞内进行代谢。迄今为止，报道的受体已有很多种，研究最详细的是LDL受体，其次是清道夫受体，再就是VLDL受体，这三种受体的氨基酸序列。构象及与配体的结合部位都已阐明，并且已成功地得到cDNA。Brown和Goldstein于1974年研究家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia,FH）患者代谢缺陷时，在成纤维细胞膜上发现了LDL受体（LDl receptor,LDL-R）的存在。以后相继发现有VLDL受体和清道夫受体。脂蛋白受体在决定脂类代谢途径、参与脂类代谢，调节血浆脂蛋白水平等方面起着重要的作用。脂蛋白受体的发现，是脂类代谢研究的里程碑，推动了脂蛋白、载脂蛋白的深入研究。

第一节　低密度脂蛋白受体

Schneider等于1982年从牛肾上腺分离出LDL受体，以后又分离出编码牛LDL受体羧基末端1/3氨基酸的cDNA，并初步阐明了牛LDL受体cDNA，推导出人LDL受体的氨基酸序列。

一、LDL受体结构

LDL受体是一种多机能蛋白，由836个氨基酸组成的36面体结构蛋白，分子量约115kD。由五种不同的区域构成（见图6-1），各区域有其独特的功能。

图6-1 LDL受体与VLDL受体结构

1．配体结合结构域配体结合结构域由292个氨基酸残基组成，其中共有47个半胱氨基酸，含有七个由40个氨基酸残基组成的与补体C_B、C_q类似的重复序列，每个重复系列中有6个Cys残基，所有42个Cys残基均已构成二硫键，重复序列2、3、6、7是结合LDL所必需的，其中任何一种发生突变，均使受体丧失结合LDL的能力。重复序列5则与结合β-VLDL有关，若该序列突变时，该受体结合β-VLDL的能力丧失60%。该受体不仅能结合LDL，还能结合VLDL、β-VLDL和VLDL残粒；它不仅能识别ApoB₁₀₀，也可识别ApoE的脂蛋白。ApoE、B₁₀₀为LDL受体的配体，因此，LDL受体又称为ApoB₁₀₀，E受体。

2．EGF前体结构域 约由400个氨基酸残基组成的肽段，有5个重复序列，每个重复序列包括25个氨基酸残基。EGF前体结构域与小鼠上皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）前躯体有同源性，这一区域因此而得名，Mutagenisis等在体外实验证实，这个区域的肽段，属于细胞膜外结构蛋白，起着支撑作用。

3．含糖基结构域 由58个氨基酸残基组成，是紧靠细胞膜面的肽段，由18个丝氨酸或苏氨酸构成0-连接糖链，对LDL受体起着支撑作用。

4．跨膜结构域 由22个氨基酸残基组成，富含疏水氨基酸残基，属于跨膜蛋白，起着固系于细胞膜中的抛锚作用。这个区域缺陷，影响受体的细胞外分泌。

5．胞液结构域 位于细胞膜的胞浆侧，由50个氨基酸残基组成，C-末端位于胞浆并“深埋”于胞浆之中。

二、LDL受体基因结构

人LDL受体基因长度45kD，由18个外显子和17个内含子组成共长达2535bp。LDL受体基因如图6-2所示。

外显子1编码短的5'侧序列及信号肽。内含子1在信号肽远端2个氨基酸处中断编码序列。配体结合域中的7个由40个氨基酸残基组成的重复序列中，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ残基序列均由各自的外显子编码，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ则由同一个外显子编码。

EGF前体结构域由外显子7至14编码其蛋白的290～690氨基酸残基。外显子15则编码LDL受体C末端的50个氨基酸。

LDL受体基因突变时可引起多种遗传疾病，典型遗传病有定族性高胆固醇（FH）。LDL受体基因突变种类包括基因大片段的缺失或插入或仅有1个碱基的改变而导致形成错误或无意义的密码（见图6-2）。

通过基因水平分析，LDL受体基因突变不外乎下列几种类型：①一类是因基因突变使LDL受体蛋白无法检出或其活性丧失，这种突变涉及到mRNA转录水平变异。如外显子1中缺6～10kb或外显子13～15kb缺失4～5kb；②另一类是因突变使分子量为120kD和ECG前驱体结构域抑制通过小胞体进入高尔基氏体的转送作用；③第三种是突变结果使LDL受体的结合LDL的能力降低；④第四种是受体结合LDL后不能内移，这种突变点在外显子16～18kb，即编码跨膜结构域的一段基因。LDL受体的四种级别变异类型如图6-3所示。

图6-2 LDL受体基因结构及其家族性高胆固醇血症的基因突变和受体蛋白变异

（引自 KajinamiK. Mabuchi H, Michishita I et al.Arteriosclerosis 8.187.1988）

图6-3 LDL受体的生物合成与四种级别的变异类型

(源自Brown MS, et al.1986)

三、LDL受体功能

LDL受体广泛分布于肝脏、动脉壁平滑肌细胞、肾上腺皮质细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞，各组织或细胞的LDL受体活性差别很大。

含ApoB₁₀₀的脂蛋白可以与LDL受体以高亲和力结合转运到肝脏，肠道分泌的ApoB₄₈不是LDL受体配体。所以肝脏不能清除完整的CM。

LDL或其他含ApoB₁₀₀，E的脂蛋白如VLDL、β-VLDL均可与LDL受体结合，内吞入细胞使其获得脂类，主要是胆固醇，这种代谢过程称为LDL受体途径（LDl receptor pathway），该途径依赖于LDL受体介导的细胞膜吞饮作用完成，如图6-3所示。当血浆中LDL与细胞膜上有被区域（coated region）的LDL受体结合（第1步），使其出现有被小窝（coated pit）（第2步），并从膜上分离形成有被小泡（coated vesicles）（第3步），其上的网格蛋白（clathrin）解聚脱落，再结合到膜上（第4步），其内的pH值降低，使受体与LDL解离（第5步），LDL受体重新回到膜上进行下一次循环（第6、7步）。有被小泡与溶酶融合后，LDL经溶酶体酶作用，胆固醇酯水解成游离胆固醇和脂肪酸，甘油三酯水解成脂肪酸，载膜蛋白B₁₀₀水解成氨基酸，见图6-4。LDL被溶酶体水解形成的游离胆固醇再进入胞浆的代谢库，供细胞膜等膜结构利用。胞内游离胆固醇在调节细胞胆固醇代谢上具有重要作用：若胞内浓度升高，可能出现下述几种情况：①抑制HCGCoA还原酶，以减少自身的胆固醇合成；②抑制LDL受体基因的表达，减少LDL受体的合成，从而减少LDL的摄取，这种LDL受体减少的调节过程称为下调（down regulation）；③激活内质网酰基CoA胆固醇酰基转移酶（acyl-Coa cholesterolacyltransferase,ACAT），使游离胆固醇在胞浆内酯化成胆固醇酯贮存，以供细胞的需要。经上述三方面的变化，用以控制细胞内胆固醇含量处于正常动态平衡状态。血浆中胆固醇主要存在于LDL中，而65%～70%的LDL是依赖肝细胞的LDL受体清除。肝脏的LDL受体还影响LDL的合成速率及VLDL代谢。曾经认为人VLDL几乎全部在血循环中转变为LDL，LDL再被肝外组织摄取，现在经大鼠和兔实验研究表明，VLDL仅有15%以下转变为LDL，人则有＜50%的VLDL转变为LDL，大部分VLDL是以VLDL或VLDL残粒的形式被肝脏摄取。VLDL残粒与肝脏受体的亲和力比VLDL大很多，VLDL中虽有少量ApoE，因含有丰富的ApoC，可掩盖ApoE，而阻碍其与肝脏的ApoE、E受体结合，因VLDL转变成VLDL残粒时，随着甘油三酯水解而丧失ApoC，暴露出ApoE，因此，VLDL残粒被肝清除的速率比VLDL快。VLDL残粒大部分被肝脏清除，一小部分在肝脂酶作用下水解除去甘油三酯而转变成LDL。LDL受体还在乳糜微粒代谢中起有一定作用。由于乳糜微粒中的ApoB₄₈不能识别ApoB₁₀₀，E受体。所以肝脏不能清除完整的乳糜微粒。但是血管中乳糜微粒被脂蛋白脂肪酶水解去除其大部分甘油三酯核心后，同时丧失部分ApoC、A，生成乳糜微粒残粒除去了阻碍ApoE与受体结合的因素，故可迅速被肝脏清除。LDL约有一半是通过LDL受体，另一半通过LDL受体相关蛋白进行代谢，其半寿期短，

总之，LDL受体主要功能是通过摄取胆固醇进入细胞内，用于细胞增殖和固醇类激素及胆汁酸盐的合成等。

图6-4 LDL受体胞吞作用示意图

第二节　极低密度脂蛋白受体

在ApoB100存在下，LDL受体可结合LDL；在ApoE存在下，既可结合LDL，又可结合VLDL、β-VLDL。与LDL受体不同，还有一种仅与ApoE脂蛋白结合的特异受体存在，据以下临床现象及实验结果推测还有另一种受体的存在：①纯合子FH，患者血中乳糜微粒残粒并不增加；②LDL受体缺陷的WHHL兔乳糜微粒残粒仍正常地被肝脏摄取；③LDL受体下调状态下，乳糜微粒残粒可在肝脏异化，FH的LDL受体缺陷者或WHHL兔巨噬细胞不能利用LDL使其泡沫化，但可利用含ApoE脂蛋白的乳糜微粒残粒及β-VLDL使其泡沫化，所以推测有对ApoE特异结合的第二种受体存在，即极低密度脂蛋白受体（VLDl receptor, VLDL-R）。

利用cDNA单克隆已证明有VLDL受体存在，其结构与LDL受体类似，如图6-1所示。有与LDL受体相同的五部分组成，即配体结合结构域，EGF前体结构域，含糖基结构域、跨膜结构域和胞液结构域。然而并非完全相同，配体结构域，有55%相同性（图6-4）；EGF前体结构域有52%的相同性；含糖基结构域仅有19%相同性；跨膜域有32%相同性；胞浆域有46%的相同性，如图6-5、6-6所示。LDL受体对含ApoB₁₀₀的LDL，含ApoE的VLDL，β-VLDL，VLDL残粒有高亲和性。VLDL受体仅对含ApoE的脂蛋白VLDL，β-VLDL和VLDL残粒有高亲和性结合并摄入细胞内，对LDL则为显著的低亲和性。VLDL受体在能量代谢活跃的心脏、肌肉、脂肪等组织细胞存在，肝脏几乎未发现，这是因为与提供组织脂肪酸机能由LPL单独承担有关。即①LPL分解结合在受体上的VLDL，水解得到的游离脂肪酸扩散通过细胞膜入细胞内，以提高利用率；②VLDL受体与LPL的mRNA有同一组织的特异性；③VLDL受体结合含ApoE的TG脂蛋白能力很强；④LPL缺损者皮下脂肪的蓄积不正常。从这几方面去考虑，VLDL受体对富含TG脂蛋白代谢起有重要作用。人VLDL受体与兔VLDL受体有97%的同源性，同人LDL受体有76%的同源性。已证实它的mRNA在组织中高度表达的结果，对这些组织细胞的脂肪酸代谢功能具有重要的意义，如肌细胞、脂肪细胞、心脏、脑和胎盘细胞等。

图6-5 LDL受体与VLDL受体基因结构的异同示意图

图6-6 LDL受体与VLDL受体的配体结合结构域及胞液结构域的比较

配体结构域的VLDL受体和LDL受体均保留有SDE（Ser-Asp-Glu）序列，LDL受体有7个突变序列，VLDL受体则有8个重复系列。以胞液结构域比较，LDL受体与VLDL受体均有被小窝信号肽（coated pit signal）的FDNPVY结构，其功能是与配体结合摄取进入细胞内。另外LDL受体胞液结构域，在肝细胞内侧存在向基运输小窝（basipetal translocation pit）的[RNxDxx(S/T)xxS]结构，VLDL受体则无此小窝，如图6-6所示。

LDL受体受细胞内胆固醇负反馈抑制，VLDL受体则不受其负反馈抑制，当VLDL受体的mRNA量成倍增加时，不受LDL乃至β-VLDL的影响。这是因为VLDL的配体关系使β-VLDL的摄取不受限制。这一点，对由单核细胞由来的巨噬细胞的泡沫化在早期动脉粥样硬化的斑块形成中有重要意义。

VLDL受体在脂肪细胞中多见，可能与肥胖成因有关。

第三节　清道夫受体

遗传性的LDL受体缺陷的杂合子是不能摄取LDL的，但动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞有从LDL来的胆固醇酯大量蓄积并泡沫化，其原因用LDL受体途径无法解释，因为从这条途径不能摄取对过多的脂质。同时经LDL受体摄入脂类的量是受细胞内胆固醇水平的调节。Brown与Goldstein等使LDL乙酰化，从而导致不受细胞内胆固醇调节的过剩脂质也摄入并出现异常蓄积，进而推测存在一种LDL受体途径以外的脂质摄取途径，使巨噬细胞摄取乙酰化LDL。Brown等人提出这种设想并定名为清道夫受体（scarenger receptor）。以后许多实验证明了这种推测。1984年Heinecke等人在细胞培养液中添加氧化剂使LDL氧化修饰，其结果使巨噬细胞摄取了这种变性LDL。现在认为，人体内脂质过氧化反应导致的变性LDL，可被巨噬细胞无限制地摄人细胞内，这是因为变性LDL上带有各种分子的负电荷而与清道夫受体结合。

一、清道夫受体结构

Komada等于1990年用配体亲和层析和免疫亲和层析，将牛肺巨噬细胞清道夫受体纯化，并由其部分氨基酸序列（见图6-7）克隆得到Ⅰ型、Ⅱ型清道夫受体cDNA，以后相继将人、兔和小鼠的清道夫受体cDNA克隆成功。该受体C-末端为半胱氨酸的为Ⅰ型，具有短肽结构的为Ⅱ型清道夫受体。以三聚体形式存在，分子量为22kD的膜糖蛋白。N末端在细胞膜内侧，C末端在膜外侧存在，是“inside out”型的受体。该受体的Ⅰ、Ⅱ型均由6个区域部分组成，如图6-8所示。

1．N-端胞浆域 由50个氨基酸残基组成，可能与包涵素结合，类似LDL受体结构。其中央部分是磷酸化部位，摄取配体的最重得要的部位。

2．跨膜域（transmembrane） 由第51～76氨基酸残基构成。为疏水性氨基酸组成的单一结构，“抛描”固定于细胞膜上。

3．间隔域 由第77～150氨基酸残基构成。

4．α-螺旋卷曲螺旋域（α-hericalcoiled-coil）由第151～271共121个氨基酸残基组成。在这段蛋白中，其中含糖基结构域中有7个氨基酸残基组成的一含疏水性氨基酸的高氨酸拉链（leucine-zipper-helix）结构或者称为“七联体”，如图6-9所示，这种结构可以多达23个。

图6-7 清道夫受体氨基酸序列比较

图6-8 清道夫受体结构模式图

图1-9 清道夫受体的亮氨酸拉链结构

图中为α-螺旋卷曲螺旋域中的螺旋轮示意图（人与牛）

亮氨酸拉链结构的肽段先叠成右手α-螺旋，每一圈含3.5个氨基酸。尔后这些α-螺旋以疏水氨基酸中心构成的平行的三聚体结构。该结构域内，亮氨酸与异亮氨酸残基出现部分对人则是分别为155～203和240～272氨基酸残位置。

5．胶原蛋白样域 属第273-343个氨基酸残基肽段，这种序列与胶原蛋白非常相似，推测这段肽链为右手胶原蛋白样三联体螺旋。

6．C端侧特异域 属第344～453个氨基酸残基肽段，为羧基末端。该段富含半胱氨酸。清道夫受体的8个Cys有6个在此域范围，所以称为清道夫受体富半胱氨酸域（scavenger receptor cystein rich domain like, srcR域）。半胱氨酸的二硫键交联而成的区域非常紧密，牢固，形成球状，足以经受细胞外环境的变动，属于细胞外区域。

srcR域长约430nm，犹如三朵郁金香的“花苞”，有由间隔域到α-螺旋卷曲螺旋域构成的“花茎”为支撑，这一“花茎”约占总长度的52%或胞外部分的62%。Ⅱ型清道夫受体没有srcR域，代之以6个氨基酸残基，所以是“截短”的清道夫受体。但Ⅱ型清道夫受体比Ⅰ型清道夫受体具有高亲和力结合和介导内移修饰LDL作用。

二、清道夫受体配体

清道夫受体配体广泛，有：①乙酰化或氧化LDL等修饰的LDL；②多聚次黄嘌呤核苷酸和多聚鸟嘌呤核苷；③多糖如硫酸右旋糖酐；④某些磷脂，如丝氨酸磷脂，但卵磷脂不是配体；⑤细菌脂多糖，如内毒素等。这样广泛的配体谱的共同特点是多阴离子化合物。Ⅱ型清道夫受体没有srcR域，但仍具有Ⅰ型相同的功能，显然配体结合域不在srcR域，推测其结构域在胶原蛋白样域C末端的22个氨基酸残基作为配体识别位点。是结合多阴离子配体所必需的位点。

三、清道夫受体功能

目前对于清道夫受体的功能还不十分清楚，是人们在研究巨噬细胞转变成泡沫细胞的机制时发现的。近年来大量实验证明LDL可被巨噬细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞氧化成氧化LDL，可通过清道夫受体被巨噬细胞摄取，形成泡沫细胞，氧化LDL还能吸引血单核细胞粘附于血管壁，对内皮细胞有毒性作用等，从而促进粥样斑块形成。这些研究无疑阐明了巨噬细胞的清道夫受体在粥样斑块形成机制中起有重要的作用，另一方面，也推测巨噬细胞通过清道夫受体清除细胞外液中的修饰LDL，尤其是氧化的LDL，是机体的一种防御功能。可清除血管壁过多脂质；清除病菌毒素，摄取内毒素多方面的功能。

清道夫受体分布于胎盘，肝脏、脾脏等网状内皮系统，脑组织也有Ⅰ型和Ⅱ型。

清道夫受体不仅在组织巨噬细胞内发现有，在单核细胞分化由来的巨噬细胞侵入内皮的过程中也见有该受体。兔、大鼠高脂肪膳食模型制作过程中，喂饲高胆固醇开始的的几天见到LDL样粒子附着于血管壁，其后有单核细胞附着于内膜、巨噬细胞导致脂肪线条病巢形成并出现成百成千巨噬细胞簇出现，此时发现有大量的清道夫受体，病灶逐步进入平滑肌细胞内膜，然而其深部巨噬细胞仅有少量残存受体，其量也逐渐减少。当变性LDL显著增加时，清道夫受体摄取的脂质则不受制约，目前认为这是脂质沉积的重要原因，也是动脉粥样硬化发病的重要机制。使LDL变性的主要因素是脂质的过氧化，而何种原因引起脂质过氧的，有待进一步研究。

（周新）

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第七章　脂类代谢有关的特殊蛋白质

脂类代谢过程中的非极性CE和TG以及载脂蛋白，在脂蛋白之间进行转运和交换。这种交换转运是否需要载体，如何转运，各脂蛋白之间的脂质和蛋白又如何达到平衡，早在60年代，人们已开始了饶有兴趣的研究。1968年Akenumz与Glomset等发现血浆中有LCAT能催化HDL上Ch变成CE，转运到CM及VLDL或其他脂蛋白上，并很快达到平衡。其后陆续有多种参与脂蛋白代谢的蛋白质因子被发现。从蛋白质的生物学性质及功能看，这类蛋白因子似乎是酶，但又不具备酶学特征；似乎是受体，也不具备作为受体的特点，这种似酶非酶，是受体非受体的蛋白质，本章只好暂且称其为脂类代谢有关的特殊蛋白质。

第一节　胆固醇酯转移蛋白

早在1975年，Zilvermit等发现兔血浆无脂蛋白部分含有使胆固醇酯转运的特殊蛋白质。Barter等报道兔血浆d＞1.21g/ml部分存在有促进脂蛋白和TG交换的蛋白因子，其后从高胆固醇血症兔血浆中分离得到这种活性蛋白，能促使HDL与LDL和VLDL之间进行CE交换，以后的研究中又发现这种质白质与动脉粥样硬化发生密切相关，这种特殊蛋白被之谓胆固醇酯转移蛋白（cholester ester transfer protein, CETP）。

一、CETP结构

CETP又称为脂质转运蛋白（lipid transfer protein, LTP），从血浆d＞1.21g/ml组份中精制得到，是由467个氨基酸残基组成的单链多肽，其中非极性氨基酸残基高达45%，是一种疏水性蛋白质，很容易被氧化而失活。CETP由肝脏、小肠、肾上腺、脾脏、脂肪组织及巨噬细胞合成，细胞内成熟蛋白分子量为74000。最近已阐明其结构编码基因存在于第16染色体。与LCAT的基因靠近。CETP基因由16个外显子和15个内含子约20.5kb组成。

二、CETP生理功能

CETP促进各脂蛋白之间脂质的交换和转运。他催化HDL₃上的胆固醇酯转运到富含ApoB的脂蛋白VLDL和LDL上，其中的TG经HTGL作用水解，使HDL颗粒缩小，CETP在完成和促进胆固醇逆转运过程中充当重要角色。周围组织细胞膜的游离胆固醇与HDL结合后，被LCAT酯化成胆固醇酯，移入HDL核心，并可通过CETP转移给VLDL，LDL，再被肝脏的LDL及VLDL受体摄取入肝细胞，至此，完成了胆固醇从周围末梢组织细胞经HDL转运到肝细胞的过程，称之为胆固醇的逆转运，如图7-1所示。

图7-1 胆固醇逆转运系统

目前认为，血浆中各脂蛋白的胆固醇酯主要通过LCAT和CETP的共同作用生成。CETP与LCAT一样也常与HDL结合在一起。

三、CETP缺乏症

血浆中CETP缺乏，HDL中CE蓄积TG降低，无法转运给VLDL及LDL，出现高HDL血症，从而使VLDL、LDL的CE减少及TG增加。这是因为从HDL将CE转运给含ApoB脂蛋白的途径出现障碍所致。利用酶联免疫方法检测血浆中CETP活性，其活性很低。

图7-2 LDL形成的两条途径

因CETP的缺陷可引起高HDL血症，其中出现有富含ApoE和CE的类似于HDL_c的多相分散LDL（polydisperse LDL）。利用平衡密度梯度超速离心可使这种多相分散LDL显示出16个亚组份。采用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳，血胆固醇水平正常的人LDL仅显示一个单一的区带。若CETP缺乏者，LDL可显示两条区带，其后进一步阐明，这两个区带是属于密度相同，其理化性质有差异的大小两种颗粒的LDL。究其原因，是因为LDL的成熟过程有大LDL和小LDL途径，如图7-5所示。ECTP的作用是促使HDL的CE转运到LDL中，使其形成成熟均一的LDL，CETP是LDL成熟的必]需因素。

利用酶联免疫法测定CETP缺陷者，血清CETP水平低于健康人，其量与HDL-C呈负相关。实验证明，CETP缺陷的纯合子，转运CE的作用完全丧失。经PCR及DNA测序确认，CETP缺陷常在基因内含子14的剪接供体位点上易发生G→A突变。据报道，CETP缺陷者可出现于杂合子，又可出现于纯合子。据此推测，CETP缺陷者可能是一种复合型异型合子（compound heterozygote）。

CETP缺陷是引起高HDL血症的原因，然而血浆中CETP的活性差异很大。血浆CETP活性低的动物，胆固醇负荷实验发现，很易引起动脉粥样硬化，而HDL-C呈高值；CETP活性高的动物进行胆固醇负荷实验发现，也很容易引起动脉粥样硬化，然而HDL-C为低值。这种有趣的现象令人费解。然而最大的可能是，CETP以几种不同的表型发挥着不同的生理功用之故。因此，与其说CETP的某一表型是CE转运蛋白还不如说是致动脉粥样硬化的因子。

总之，CETP缺陷是引起动脉粥样硬化的重要因素之一。

第二节　血清碱性蛋白

高载脂蛋白β脂蛋白血症（hyperapo beta lipoproteinemia ,HyperApoB）属遗传性脂代谢紊乱性疾病，以小而致密的低密度脂蛋白（LDL）微粒升高为主要特征，后者是冠心病的重要危险因素之一。HyperAopB的代谢缺陷为：①肝组织大量合成VLDL，致使小而致密的LDL水平升高；②餐后TG水解延迟，大量游离脂肪酸堆积在血液中。到目前为止，用ApoB基因缺陷或突变无法解释HyperAopB的各种表型，已发现来源于该病患者的脂肪细胞和成纤维细胞对游离脂肪酸的吸收和代谢存在明显障碍。Kwiterovich等正常人血清中分离出三种碱性蛋白质分子（basicproteins,BPs）-BPⅠ（Mr14.0kD,pI9.10），BPⅡ(Mr 27.5kD,pI8.48),BPⅢ(Mr55.0kD,pI8.73)，并认为BPⅠ同Cianflone等人分离纯化的酰化作用剌激蛋白（acylation-stimulating protein,ASP）系 同一种蛋白质。同正常人成纤维细胞相比，BPⅠ使HyperApoB患者成纤维细胞合成甘油三酯和胆固醇酯的能力下降约50%，而BPⅡ则明显促进患者成纤维细胞合成胆固醇酯，BPⅢ对这两种不同来源的成纤维细胞的代谢没有影响。然而，与BPⅠ和BPⅡ不同的是，BPⅢ能显著促进正常人单核源性巨噬细胞合成胆固醇酯。BPⅠ和BPⅡ主要通过蛋白激酶C（PKC）和酪氨酸蛋白激酶（TPK）途径传递信息和发挥生物效应。由于BPs与正常人脂质、脂蛋白和游离脂肪酸的代谢以及HyperAopB的病理生理变化密切相关，受到人们的普遍关注，尤其是血浆脂质代谢与补体系统之间的关系已成为许多实验室研究的热点。

一、血清碱性蛋白质的分离及其氨基酸的组成分析

最初在培养离体成纤维细胞和脂肪细胞时，偶然发现培养基中加入血清可使细胞甘油三酯（TG）的合成量增加，后来证明这是因为血清中含有一种呈碱性的蛋白质分子，根据这一特性，1988年，Cianflone采用层析法将这种蛋白质分离出来，并依据其生理功能命名为酰化作用剌激蛋白，该蛋白质分子量为14.0kD，等电点为9.10。1989年Kwiterovich采用IEF和SDS/PAGE技术从人血浆中分离纯化三种碱性蛋白质分子，并测得其分子量和等电点分别为：碱性蛋白Ⅰ（BPⅠ）14.0kD,9.10；碱性蛋白Ⅱ(BPⅡ)27.5kD,8.48；碱性蛋白Ⅲ（BPⅢ）55.0kD.8.73。分析这三种碱性蛋白质，发现他们分别由不同的氨基酸组成：BPⅠ精氨酸的含量约为BPⅡ、BPⅢ的两倍，半胱氨酸含量为BPⅢ的三倍；BPⅡ不含半胱氨酸而富含脯氨酸；BPⅢ蛋氨酸的含量是BPⅠ、BPⅡ的2～3倍，而组氨酸的含量只有BPⅠ、BPⅡ的一半，BPⅢ还富含丝氨酸。另外，这三种蛋白质都含有较丰富的非极性氨基酸，因此当用葡聚糖或聚丙烯酰胺对其进行层析法分离时，观察到的相反的现象可能是这些氨基酸在水相中相互作用的结果。而组成该蛋白质分子的Asn/Asp和Gln/Glu都以酰胺基团形式存在，保证了这些蛋白质分子的等电点呈碱性。

Kwiterovich采用免疫印迹分析表明：BPⅠ只能同抗ASP免疫血清发生特异性反应，与免疫前血清无反应。而BPⅡ和BPⅢ都能与抗ASP免疫血清和免疫前血清发生反应，因此没有理由相信BPⅡ和BPⅢ与ASP是同一种物质，但Kwiterovich认为BPⅠ和ASP为同一种物质，因为许多实验结果也显示BPⅠ和ASP具有相似的等电点、分子量和氨基酸组成，而且都具有酰化作用激活性，但目前还没有BPⅠ和ASP分子克隆的结果证实这一结论，见表7-1所示。

表7-1 碱性蛋白Ⅰ和酰化作用剌激蛋白氨基酸组成分析

氨基酸组成分析也证实BPⅠ和ASP都含有丰富的半胱氨酸，可以凭借其形成二硫键产生广泛的生物学效应,一般这些半胱氨酸残基都以氧化的形式存在,当采用含β-巯基乙醇的缓冲液来纯化ASP时,其生物活性会完全丧失,可见半胱氨酸的存在对维持其酰化作用剌激活性很有必要.现已证明，BPⅠ、BPⅡ、BPⅢ的生理功能不同于胆固醇转运蛋白（sterol carrier protein ,SCP）和脂肪酸连结蛋白（fatty-acidbinding protein ,FABP），也不同于其他碱性蛋白如髓鞘碱性蛋白（MBP）。

二、血浆碱性蛋白对细胞脂质代谢的影响

碱性蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ都具有酰化剌激活性，能剌激成纤维细胞合成TG，胆固醇酯（ChE）和磷脂（PL）。1994年，Peter分别采集了6个健康成人和6个家族性高载脂蛋白β脂蛋白血症患者的成纤维细胞进行细胞脂质代谢的研究：在正常人培养的成纤维细胞中，BPⅠ、BPⅡ和BPⅢ分别使其细胞内甘油三酯（TG）的含量增加2、1.5和1.4倍；但在HyperApoB患者成纤维细胞中，BPⅠ的作用下降了50%，而BPⅡ和BPⅢ仍能发挥其有效的酰化作用剌激活性。

在正常成纤维细胞，BPⅠ也有剌激胆固醇酯合成的能力，而在HyperApoB患者成纤维细胞，BPⅠ的这种作用基本上消失了。但BPⅡ能使HyperApoB患者成纤维细胞内胆固醇酯的含量异常升高至正常细胞含量的六倍，而且BPⅡ对胆固醇酯和总胆固醇的影响是平行的，游离胆固醇未发现有何变化。BPⅠ还可使正常细胞总磷脂含量升高约两倍，而在HyperApoB患者成纤维细胞，BPⅠ对磷脂的合成代谢影响甚微，只相当于正常细胞约三分之一的能力。

已有研究表明，未用碱性蛋白（BPs）处理的正常细胞和HyperApoB患者细胞，其脂质代谢无显著性差异，表明碱性蛋白（BPs）的作用机制可能是加速细胞合成脂质或抑制细胞内脂质的水解。Teng等发现在正常人脂肪细胞，ASP（或BPⅠ）的作用是促使甘油三酯（TG）合成增加而不是抑制了细胞内甘油三酯的水解，同样，在HyperApoB患者脂肪细胞内甘油三酯的减少不是由于（BPⅠ）使甘油三酯水解增加而是使其合成减少。因此Kwiterovich认为BPⅠ促进正常细胞合成甘油三酯，而HyperApoB由于存在某些缺陷限制了BPⅠ的酰化剌激活性。

三．不同脂质、脂蛋白和LDL-ApoB浓度下碱性蛋白对细胞代谢的影响

Kwiterovich 选择正常人和家族性高载脂蛋白β脂蛋白血症患者成纤维细胞进行培养，分别观察碱性蛋白Ⅰ、Ⅱ在不同脂质、脂蛋白和LDL-ApoB浓度下对细胞油酸代谢的影响，结果发现BPⅠ剌激油酸转化为甘油三酯的比率与血浆总胆固醇、甘油三酯、LDL-C和LDL-ApoB水平呈显着性相关（P＜0.01），同血浆高密度脂蛋白浓度正相关（P＜0.05），相似的关系也见于油酸转化为胆固醇酯的过程中。因此认为BPⅠ可能影响HyperApoB的病理生理过程，对各种表型的形成起重要作用。如总胆固醇、甘油三酯、LDL-ApoB浓度越高，则高密度脂蛋白浓度越低。而Cianflone则认为，除了家族性高胆固醇血症，酰化作用剌激蛋白（ASP）诱导成纤维细胞合成甘油三酯的量与血浆低密度脂蛋白水平呈负相关，与血浆高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白水平无关。

同BPⅠ相反，BPⅡ诱导胆固醇酯合成的量同血浆总胆固醇、LDL-C和LDL-ApoB的浓度呈显著性正相关（P＜0.01），同血浆高密度脂蛋白水平呈负相关（P=0.06），同血浆甘油三酯的浓度有正相关趋势（P=0.01）。同样，BPⅡ剌激高载脂蛋白β脂蛋白血症患者成纤维细胞合成胆固醇酯的能力与血浆高水平的LDL-C和LDL-ApoB密切相关，血浆高水平的LDL-C和LDLApoB为BPⅡ促进胆固醇的大量酯化创造了良好的条件。碱性蛋白Ⅱ（BPⅡ）可能以不同于碱性蛋白Ⅰ（BPⅠ）的方式影响血浆LDL浓度：BPⅠ主要通过影响外周细胞（如脂肪细胞）而发挥生物效应，因为在HyperApoB患者外周细胞对游离脂肪酸的转化降低；而BPⅡ则促进肝组织对游离脂肪酸的吸收并剌激肝细胞合成分泌载脂蛋白B。

碱性蛋白Ⅲ（BPⅢ）能显著剌激单核细胞源性巨噬细胞合成胆固醇酯，而对甘油三酯的代谢无影响。BPⅠ和BPⅡ对单核源性巨噬细胞的甘油三酯和胆固醇的代谢没有影响，表明碱性蛋白生物效应可能具有细胞特异性。

四、酰化作用剌激蛋白与细胞的连结

同正常人成纤维细胞一样，酰化作用剌激蛋白（ASP）能明显促进家族性高胆固醇血症和LDL-ApoB水平正常的IV型高脂蛋白血症患者的成纤维细胞合成甘油三酯，并且ASP与成纤维细胞结合具有一定的特异性，结合曲线可呈饱和状态，表明家族性高胆固醇血症和LDLApoB水平正常的IV型高脂蛋白血症患者，同正常细胞一样具有同一类ASP受体，而且该受体的最大亲和力与正常对照组基本一致。

研究表明，ASP与正常细胞和HyperApoB细胞连结的典型曲线为矩形双曲线。Scatcharel线性回归分析表明，正常细胞的斜率为-0.068±0.01(μg/ml)^-1而HyperApoB患者细胞的斜率为-0.08±0.02(μg/ml)^-1统计学无显著性差异，而HyperApoB细胞x轴截距只相当于正常细胞的一半这些结果表明，ASP与正常细胞和HyperApoB患者细胞表面受体的连结都呈单级式，kD值为1.05×10^-6M，只是HyperApoB细胞表面受体下降了一半。但有研究表明，只有约50%的HyperApoB患者细胞存在这种缺陷，且此种缺陷与高脂血症的严重程度无关。Babirak则认为脂蛋白脂肪酶的活性缺失也可能导致高载脂蛋白β脂蛋白血症，而并未发现该患者的外周细胞表面的酰化剌激蛋白受体有所减少。

同胰岛素相比，ASP可能更有促进脂肪组织合成甘油三酯的潜力，对餐后脂肪酸的分布发挥其重要作用。ASP调节外周脂肪组织吸收脂肪酸合成甘油三酯，迅速解除游离脂肪酸对脂蛋白脂肪酶（LPL）活性的抑制，促使LPL更有效地水解餐后升高的甘油三酯，并改善LPL对富含甘油三酯的脂蛋白的清除，而HyperApoB患者由于细胞膜ASP受体数目降低，外周组织不能有效地利用血浆中的脂肪酸和葡萄糖，致使大量脂肪酸重新分布到肝组织，剌激肝细胞合成并分泌大量ApoB，装配VLDL和LDL。

五、碱性蛋白的信使传递途径

碱性蛋白Ⅰ和碱性蛋白Ⅱ可能是通过第二信使系统介导而影响细胞甘油三酯和胆固醇酯的代谢。Peter选择蛋白激酶C（PKC）的激活剂和抑制剂来研究BPⅠ、BPⅡ的作用途径，H-7是PKC较为有效的抑制剂，其作用是参与ATP竞争而不是与Ca²⁺或磷脂相互作用，实验结果表明，H-7抵消了HyperApoB患者细胞对BPⅠ的反应性，而且HyperApoB患者细胞对BPⅡ异常反应也被高浓度的H-7所遏制。在缺乏BPs时，PKC的激活剂C：8能同样有效地剌激正常细胞和HyperApoB患者细胞，表明在HyperApoB细胞，经甘油二酯（DG）途径激活PKC的过程无异常。但当BPs存在时，HyperApoB细胞的代谢缺陷并不因为PKC的激活剂C：8的出现而有所改善，所以HyperApoB的代谢缺陷不是在DG-PKC途径，而在第二信使系统的其他环节上。

Baldo也认为ASP是通过蛋白激酶C（PKC）途径介导而发挥生物效应的，因为PKC的激活剂豆寇酰佛波乙酯（PMA）和1-油酰基-2-乙酰-rar-甘油（OAG）能模拟ASP的生物效应，当成纤维细胞对PMA和OAG的反应性处于饱和状态时，改变培养基中的ASP浓度，并不能使甘油三酯的合成增加；PKC特异性抑制剂星形孢菌素Cal-phostinC和GF109203x也可完全抑制ASP的生物活性；ASP可使细胞内DG合成增加，而DG是PKC的有效激活剂；ASP激活PKC从胞浆转位到细胞膜，使细胞膜对脂肪酸的吸收和葡萄糖的转运增加。

为了进一步明确HyperApoB患者的细胞变异环节，1995年，Kwiterovich采用染料木黄酮（genistein）作为探针来研究正常细胞和HyperApoB患者细胞对BPⅠ的反应性。结果显示木黄酮存在时正常细胞和HyperApoB患者成纤维细胞的脂质代谢存在明显差异，可以推测酪氨酸蛋白激酶（TPK）的磷酸化在HyperApoB病理生理过程中扮演重要角色，且这一现象也被其他两种TPK抑制作用所证实（herbimycinA和tryphostinA₄₇）。

在缺乏BPⅠ的F-12培养基中补充木黄酮（92.5nmol/ml），正常细胞甘油三酯含量下降10%，而HyperApoB患者成纤维细胞中总胆固醇和非酯化胆固醇含量下降25%。正常成纤维细胞和HyperApoB患者成纤维细胞中总胆固醇和非酯化胆固醇的量都显著减少，且HyperApoB患者成纤维细胞这两种脂质下降更显著，还没有发现成纤维细胞内胆固醇酯有何变化。当用BPⅠ和木黄酮（或者herbimycinA、tryphostinA₄₇）处理培养基后，正常细胞合成甘油三酯的量与只用BPⅠ处理HyperApoB细胞合成甘油合成甘油三酯的量一致。这些现象表明，BPⅠ的生物活性，是通过位于细胞膜上TPK所介导的HyperApoB细胞，对BPⅠ反应性缺失，由于TPK的磷酸化为一些TPK的抑制剂所阻断，经木黄酮处理的正常细胞和HyperApoB细胞仍对BPⅠ有一些残余反应，其机理有待进一步探讨。

非受体型TPK包括SH₂和SH₃两个功能域，通过磷酸化作用，激活跨膜受体TPK，实际上SH₂和（或）SH₃蛋白是磷脂酶C-r（PLC-r）、ras-GTP酶活化蛋白（ras GAP）和磷脂酰肌醇3激酶（pI-3K）的同系物，其功能是裂解4，5二磷脂酰肌醇为DG和三磷酸肌醇（IP₃），因此这些SH₂和SH₃蛋白也具有TPK活性，并放大TPK的信号，最终将其传到核内的转录机构，以调节特定基因的表达或通过改变细胞内蛋白的功能状态，使细胞的代谢水平发生变化，已证实HerbimycinA直接抑制PLC-r。因此，HyperApoB的细胞缺陷可能存在于跨膜受体TPK，也可能存在于原型细胞质信号蛋白的识别和结合方式。

从目前的资料来看，木黄酮对BPⅠ生物活性的抑制不是通过降低HMGCoA还原酶的活性而实现的，因为木黄酮能抑制甲羟戊酸内酯转变成非酯化胆固醇，而不能抑制HMGCoA还原酶的磷酸化。Sato已经阐明HMGCoA还原酶的磷酸化可降低其催化能力，如果木黄酮抑制了HMGCoA还原酶的磷酸化，那么将使胆固醇的生物合成增加而不是降低，但是这样无法解释经木黄酮处理的正常成纤维细胞和HyperApoB细胞内总胆固醇和非酯化胆固醇的量显著减少而胆固醇酯的变化不大的现象。

六、脂肪信号Adipsin-ASP系统

1983年，Spiegelman用梯度凝胶电泳和Northern杂交技术检测培养的鼠3T₃脂肪细胞和前脂肪细胞总mRNA水平时，发现脂肪细胞较前脂肪细胞多三条特异的mRNA带，其中adipsin mRNA是分化的脂肪细胞所特有的，尤其在鼠的白色和褐色脂肪组织adipsinmRNA水平分别下降75%和68%，在胰岛素缺失的实验模型中，adipsin mRNA水平增加2～3倍，而在遗传性肥胖实验模型中，脂肪组织adipsin mRNA水平降低96%～99%。许多研究表明，adipsin是一种丝氨酸蛋白酶，由脂肪组织和坐骨神经产生，存在于循环血液中。Rosen用酶分析认为adipsin具有补体因子D的活性，而抗体中和试验也强烈提示鼠adipsin是人补体因子D仅有的同系物，White采用氨基酸序列分析表明adipsin同丝氨酸蛋白酶家族中主要成员有30%同源性，而与人补体因子D有60%同源性，而且经重组的adipsin可能替代补体因子D激活补体旁路途径。另外还发现，在肥胖型老鼠的血液中，补体因子D的活性也随着adipsin mRNA的水平下降而降低。最近White对人adipsin mRNA的成功克隆最终证实了adipsin和补体因子D为同一种物质。

在脊椎动物，补体系统是主要免疫防御体系之一。外来微生物的溶解是通过激活了抗体依赖性补体激活途径或抗体非依赖性补体激活途径来实现的，这两种激活途径都可形成裂解成孔复合体（lytic pore complex），破坏感染的细胞膜成分，导致细胞的裂解。我们知道，大多数补体蛋白都是由肝细胞和免疫细胞合成的，而脂肪组织特异性蛋白酶adipsin是人补体因子D的同系物，说明补体旁路激活与脂肪细胞的生物学行为间存在某种联系，受这一结果的启发，Lisa终于取得令人满意的结果：脂肪细胞和脂肪组织，还可合成补体旁路激活途径中的另外两个关键补体因子C₃和B，表明脂肪组织在局部的免疫防御反应中起有重要的作用。SDSPAGE分析表明，补体因子B和D由一条多肽链组成，而C₃由两条链组成，C_3α（110kD）和C_3β（70kD）之间由二硫键相连。将因子C₃、B和adipsin/D放在一起孵育发现，adipsin/D将因子B酶解为B_a和B_b，因子B_b与C₃相连形成C₃转化酶，将C₃裂解为C_3α（110kD）和C_3α（9kD）。过敏毒素C_3α可能改变血管的通透性和收缩性，是一种趋化性细胞因子，能诱导单核细胞释放IL-1，B_a和B_b，调节淋巴细胞的生长，B_b还诱导人单核细胞的扩展，抑制单核细胞的迁移。

ASP是一个更具潜力的脂肪酸酰化剌激因子，他诱导TG合成具有双重效应：其一，ASP诱导葡萄糖经细胞器运输到细胞表面，使细胞膜对葡萄糖特异性转运增加，尽管细胞膜对脂肪酸的转运是由ASP间接引起的，但细胞对脂肪酸净吸收量的增加激活了甘油三酯合成的限速酶-甘油二酯酰基转移酶：其二，ASP实际上是补体C₃的一个片段，命名为C_3αdesArg，他具有调节细胞内甘油三酯合成的功能。

1993年，Baldo对ASP进行了氨基酸组成、分子量和N-端氨基酸序列分析发现，ASP和C_3α的氨基酸组成非常接近，只是C_3α比ASP多一个精氨酸，且N-端氨基酸序列均为N-Ser-Val-Gln-Leu-Thr-Glu-Lys-Arg-Met-ASP，离子喷射电离技术也证实ASP的质量单位（8933±0.3）与C_3αdesArg（8932.5）一致，而不同于C_3α（9088.7）.

在血浆羧肽酶的作用下，C_3α羧基未端Arg很容易被水解掉而形成C_3αdesArg，尽管C_3αdesArg曾被认为是C₃的非活性产物，只有过敏毒素的作用，然而目前的资料已显示C_3αdesArg确实能够促进细胞甘油三酯的合成。

已经明确，ASP能剌激成纤维细胞、脂肪细胞和HepG₂细胞合成TG，且对分化的脂肪细胞影响最大，胆仍没有证据表明ASP对脂质水解有何影响，因为HyperApoB细胞TG的含量下降是由于该细胞对ASP的反应性下降而非细胞内TG的水解增加所致。但Cianflone在分子水平利用RT-PCR技术检测了甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）、脂蛋白脂肪酶、adipsin、因子C₃和因子b mRNA水平与ASP（C_3α-desArg）之间的关系后发现，成纤维细胞和未分化的前脂肪细胞只能合成微量ASP，而分化的脂肪细胞在相同时间内产生大量ASP（是前者的8倍）；成纤维细胞和分化的脂肪细胞内GAp mRNA水平无差异，而LDL mRNA在分化的脂肪细胞内明显增加，其意义有待进一步探索。另外，分化的脂肪细胞内因子C₃和adipsin mRNA水平异常升高，因子B mRNA水平只略有升高，这些变化与ASP（C_3α-desArg）大量增加平行。

因此，adipsin/D-ASP/C_3α-desArg系统可能具有非常重要的生理意义。当脂肪组织对脂肪酸的摄取能力下降时，大量脂肪酸滞留于血浆中，LPL的活性则受到严重抑制，不能有效水解血浆中的TG，而Adipisn-ASP系统可以上调脂肪组织对血浆游离脂肪酸的吸收率，使血浆中游离脂肪酸的水平不致于上升到有害的程度，LPL也能充分发挥其有效的生物活性，水解血浆中的TG和富含TG的脂蛋白，有效地调节甘油三酯的水解和合成。

七、HyperApoB的病理生理

HyperApoB是Sniderman分析了大量临床资料后于1980年首先提出的，该患者脂代谢紊乱的主要表现是血ApoB和LDL水平升高，LDL-C同LDL-ApoB之比明显降低。据Montreal心脏研究中心对100例HyperApoB合并冠状动脉粥样硬化患者实施主动脉-冠状动脉搭桥术后，十年随访结果显示：血清LDL-ApoB水平升高和HDL-ch水平降低是冠状动脉粥样硬化病变进展的两个最有价值的指标，不管是发生在原位冠状血管，还是在隐静脉旁路移植块。Brown等对血清LDL≥72.5μmol/L、有冠状动脉搭桥术史和早发冠心病的遗传背景的患者采用控制饮食和降低脂质相结合的治疗方案。结果表明：当血清LDL-ApoB的浓度下降时，冠状动脉内的粥样斑块也随之消退。

正常人的LDL是一类非均质的大分子物质，密度为1.019～1.063kg/L,HyperApoB患者LDL的分子量小于2.0×10⁶D，直径仅有23nm,Sf值也小于5.0，而密度则高达1.055kg/L，该患者LDL组成分析表明，胆固醇酯的含量明显降低，ApoB含量明显升高，而甘油三酯、磷脂和非酯化胆固醇含量基本不变。另外，HyperApoB患者往往合并血清Lp（α）水平升高，而PROCAM研究中心则认为血清Lp（α）水平与ApoB或ApoA-Ⅰ的浓度变化无关。

大量研究显示HyperApoB患者体内LDL受体活性是正常的，并认为LDL-ApoB的增加是大量VLDL-ApoB的继发性改变。于是，许多实验室开始研究HyperApoB患者ApoB的分子或基因变异情况，Gavish应用ApoB的单克隆抗体封闭ApoB的某种抗原点位，发现LDL-ApoB的浓度。但大规模遗传连锁分析还没有确认HyperApoB患者同ApoB基因所在染色单体之间的关系，而且Johns Hopkins冠心病研究小组也没有发现ApoB的影响变异与HyperApoB之间存在某种密切关系。

从目前资料来看，ApoB的基因变异或缺失似乎对HyperApoB的影响甚微，无法解释HyperApoB的各种表型。已发现HyperApoB每一种表型都存在于两种代谢障碍。其一，肝组织大量合成VLDL，致使致密的LDL水平升高，Teng用ApoB的单克隆抗体分别封闭致密和疏松的LDL微粒，发现致密的LDL与LDL之间向乎无反应，而疏松的LDL微粒与LDL受体之间的高亲和力下降，致使LDL表面的ApoB重新分布。来自动物体内和体外的实验结果也证实疏松的LDL很容易从血液循环中清除，而致密LDL常需要很长时间。Kwiterovich认为致密LDL可能通过清道夫受体途径从血液中清除，这种代谢方式将促成动脉粥样硬化的形成和胆固醇酯在血管壁的沉积，但研究结果出乎意料，来源于HyperApoB患者体内的LDL并不能促进正常人或HyperApoB患者单核源性巨噬细胞大量合成胆固醇酯。而且Knight等也没有发现单核源性巨噬细胞优先吸收和降解HyperApoB患者的致密LDL。其二，从饮食中摄入的脂肪经乳糜途径延迟，血中游离脂肪酸的浓度明显升高。Sniderman等的研究表明脂肪细胞和成纤维细胞摄取游离脂肪酸合成甘油三酯的能力下降，可能是血中游离脂肪酸水平升高的主要原因，而游离脂肪酸则诱导肝细胞合成和分泌装配VLDL的载脂蛋白B。

由于血清碱性蛋白与脂代谢密切相关，而HyperApoB的发病机制又无法从ApoB的基因变异、LDL受体和清道夫受体水平上找到合理的解释，许多实验室已将目光转入血清碱性蛋白质的研究上，并试图解开HyperApoB的发病机制。尽管目前的研究水平仍停留在对碱性蛋白质结构和功能的探讨上，但Kwiterovich已根据现有的研究成果，对HyperApoB的生化特征从碱性蛋白质及其受体的角度作出了大胆的假设，如图7-3所示。

图7-3 HyperApoB病理假说图解

综上所述，三种血清碱性蛋白质所具有酰化剌激活性确实为我们进一步认识血浆脂质、脂蛋白和游离脂肪酸的代谢及HyperApoB的致病机制提供了新的视野，但其确切的生化机制有待进一步阐明。血清碱性蛋白质与补体系统之间的关系。以及碱性蛋白的组织特异性仍将是今后研究的重点。

第三节　LDL受体相关蛋白

LDL受体相关蛋白质（LDL receptor related protein ,LRP）是Herz等于1988年发现，其组成及结构与LDL受体类同，可能属于残粒受体（remnant receptor）的一种。其后证明，LRP又是α₂-巨球蛋白（α₂-macroglobulin,α₂MG）受体。根据LRP的cDNA分析，他含有与LDL受体相同重复序列，而且与LDL受体重复序列互补的寡核苷酸可与LRP交叉杂交，所以称为LDL受体相关蛋白。LRP组成及结构见图7-4所示。

一、LRP组成及合成部位

利用寡核苷酸筛查法，已得到LRp cDNA并已阐明LRP氨基酸排列顺序，如图7-6所示。LRP由4526个氨基酸残基组成，是一种大分子量的糖蛋白，分布于大多数细胞内膜。

LRP与LDL受体，二者的配体结合结构极为相似，并与补体C8/C9结构组成具有高度类同性。

图7-4 LRP的结构与LDL受体结构比较

图7-5 LDL受体蛋白（LRP）的结构与代谢

图7-6 LRP的氨基酸序列

（引自HerzJ.1988）

细胞膜外存在的ECG前体结构域，LRP与LDL受体也类同，其中细胞外部的结构同样以三种形式存在：①20个氨基酸中有6个半胱氨酸残基，这种A基元（Amotif）带负电荷，该结构与脂蛋白结合有关；②EGF前体结构域的B基元的40个氨基酸中也有6个半胱氨酸存在，起有间隔基元的作用；③EGF前体结构域的另50个氨基酸序列中有Tyr-Trp-Thr-Asp结构，即YWTD重复序列。这一系列的相同性可能与这两种基因结构类似性有关。

LRP有两个疏水性很强的结构存在，其一是N端19个氨基酸的信号肽；其二是C端侧的组抽酸残基。跨膜结构域N端存在多个半胱氨酸，在细胞膜外侧以-S-S-键连接。LRP比LDL受体大两倍。LDL受体的有被小窝（coated pit）的第807位为酪氨酸，其周围的氨基酸组成与LRP高度相似。经有被小窝包吞作用（endocytosis）摄取细胞外物质的过程，LRP与其完全相同。在LDL受体胞液结构域的氨基酸序列中天冬酰胺-脯氨酸-X-酪氨酸（NPXY）重复序列存在，在LRP结构中也存在。

LRP在细胞粗面内质网合成，分子量为600kD（SDS-PAGE检测），在高尔基氏体内分解成515kD和85kD两种分子形式，分别称为α、β亚基，二者以非共价键结合。515kD的α亚基以贯通形式存在于细胞膜上，85kD的β亚基存在于膜内（见图7-5）。

二、LRP功能

直到目前为止，LRP的功能尚未完全清楚。LRP具有脂蛋白受体的以下特性：①摄取含ApoE的β-VLDL，摄取量与脂蛋白中ApoE含量有关；②ApoE存在时，LRP作用可促进脂蛋白的摄取；③LRP机能不受细胞内胆固醇水平的调节；④抑制含ApoC群的脂蛋白摄取，从而阻碍脂蛋白摄取。细胞内胆固醇含量不受下调作用的影响，是动脉粥样硬化灶中泡沫细胞生成的重要条件。LRP是信赖于Ca⁺⁺的蛋白质，与配体结合需要Ca⁺⁺的存在。

有报道，LRP可结合含ApoE的脂蛋白，并协同LPL的催化作用。LDL受体缺乏者，LRP起有重要作用。Kowdl和Beisiegel等报道，乳糜微粒残粒和β-VLDL均可被LRP识别；β-VLDL既可与LDL受体结合，又可与LRP结合；α₂M也可作为配体与LRP结合，β-VLDL可抑制对α₂M的摄取，以促进细胞内胆固醇酯的形成。α₂M可与丝氨酸蛋白酶等多种蛋白质分解酶结合成复合物，并可经巨噬细胞膜上的α₂M受体识别而进入细胞内，LRP则可抑制这种结合作用。LRP还可以抑制α₂M与TGF-β、b-FGF、IL-Iβ和IL-b等细胞因子的结合作用。据此推测。分子结构与α₂M受体蛋白为同一物质。利用精制的鼠肝细胞膜部分实验观察到，利用LDL受体缺乏的成纤维细胞实验，β-VLDL可竞争性抑制对α₂M的摄取，α₂M又可抑制乳糜微粒残粒的摄取。实验表明，LRP可能既是乳糜粒残粒受体，又是α₂M受体之一。

经单克隆抗体免疫学实验检测，LRP蛋白质的mRNA在肝脏、肺、脑、小肠和肌肉等组织存在，与LDL受体比较，肝脏的LRp mRNA的量约有10倍之多。通过聚合酶链反应（PCR）和免疫组织化学检查发现，在动脉粥样硬化巢病变组织里，LRP含量迅速增加，并发现内膜的粥样硬化巢里由平滑肌细胞、巨噬细胞转变的泡沫化细胞中同样也有LRP的存在。

第四节　微粒体甘油三酯转移蛋白

WetterauJ.R等于1984年发现肝细胞微粒体的离子强度缓冲液里有加速甘油三酯和胆固醇酯转运作用，用Bio-Gel A-5m和Hydroxylapatite纯化，并监测其活性，发现该蛋白的激活作用促进甘油三酯转运的活力大。经凝胶过滤测得分子量约为150kD，部分纯化产品等电点为pH5.2～5.6，该蛋白即为微粒体甘油三酯转移蛋白（microsmal triglyceridetransfer protein, MTTP）。

一、MTP蛋白质结构及特性

1991年，Wetteran J R等发现MTR由58kD和88kD的两种亚基组成的异二聚体复合物。这一特点使之与以前报道的脂质转运蛋白加以区别，以前报道的脂质转运蛋白是单一多肽，分子量从8kD到53kD不等，发现几种哺乳动物包括人的血浆中的胆固醇酯转运蛋白（CETP），均属于糖蛋白，分子量为74kD，含一个53kD的多肽骨架。

MTP的58kD的小亚基通过氨基酸分析和免疫化学分析表明他是蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI；EC5.3.4.1）早在1963年就在肝和胰腺组织中发现此酶，其功能之一是催化蛋白质生物合成中的二硫键形成，具有较宽的底物特异性。PDI在新鲜制备的鼠肝微粒体中未能检测其活性，但破膜后，可检测到二硫键异构酶活性。PDI是一种多功能蛋白，据报道他又是脯氨酰-4-羟化酶（prolyl 4-hydroxylase）的β亚单位；还与寡糖基转移酶的糖化位点结合蛋白亚组分高度相似。PDI羧基端序列Lys-Asp-Glu-Leu与内质网上相应受体结合，使之与88kD组分一起保留在内质网腔内，PDI基因定位在17号染色体。据估计，牛肝内质网腔中游离PDI浓度超过MTP中PDI浓度的五倍。此，PDI自我组装成二聚体和四聚体。MTP中PDI的二硫键异构酶活性仅是自由PDI的十分之一。

用沉降平衡实验表明，这种150kD的MTP有三种不同的沉降速率。他们分别是MTP、PDI和一个88kD的亚基。进一步用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色测定一定量MTP中PDI含量，与标准PDI比较，表明PDI：88kD亚基之比为1：0.98～1.30，证明MTP中58kD的PDI和88kD亚基化学计量为1：1。通过超速离心发现沉降系数为5.85,Stoke半径为4.7μm。用盐酸胍变性实验表明，MTP可抵抗0.8M盐酸胍的变性作用，PDI与88kD亚基结合稳定。PDI与MTP大亚基作用不可逆，到目前为止，试图用其组分或外源PDI重建MTP复合体还未功能。通过远紫外圆二色光谱分析表明，MTP约有28%α螺旋和随机结构（分别为31%和34%），而88kD亚基的β折叠占35%。

MTP的大亚基与已发现的蛋白相比未发现高度同源性。Shoulders等从MTP辨认出几个区域与卵黄磷脂蛋白的序列有低水平同源性。卵黄磷脂蛋白是产卵动物中脂蛋白复合体的蛋白质组分，由卵黄生成素裂解而成。基于氨基酸序列、分子模型和基因结构的比较，认为MTP大亚单位是卵黄生成素基因家族成员之一。

二、MTP基因结构

1993年Sharp D.等克隆MTP 88kD大亚基的cDNA并进行序列分析，比较人和牛的cDNA表明有88%核苷酸序列相同，在人MTP大亚基的3'末端有基因组DNA编码的18个腺苷酸残基，预测的分子量97kDa，人和牛MTP大亚基单位氨基酸有86%同源性，加上保守性氨基酸替换，人与牛MTP大亚基单位有94%同源性。在核苷酸和蛋白序列数据库中未发现其他蛋白与之同源。

SharpD.等MTP88kD大亚基基因结构进行分析（图7-7）。其基因跨越55～60Kb，由18个外显子组成，外显子1和18也分别包括5'和3'的非编码序列。除掉含非编码序列的外显子1和18，平均每个编码外显子的长度是153bp。

图7-7 人MTP大亚基的基因结构

上线表明基因跨度；第二线为MTP大亚基的18个外显子

示意图；第三四线分别是EcoRI（R）和Hind（H）的酶切位点。

SharpD等早期报道，人MTp cDNA 5'端非编码区有64个核苷酸。用锚定PCR检测MTpcDNA的5'末端，从两个独立PCR产物的直接序列分析揭示，从翻译起始的上游有86bp的非编码序列（见图7-8）。所有86bp5'端非翻译区均编码外显子1，外显子1还有61bp编码信号肽及成熟蛋白2个氨基酸。在翻译起始框外上游25bp有一个ATG，但该处没有适合的起始环境，第二个ATG是真正的翻译起始点。

图7-8 MTP大亚基的5'侧翼序列

转录起始点5'侧翼序列不含TATA盒，但富含AT序列，在转录起始点上游约30bp的AAAGATAAA可能被TATA结合蛋白（TFⅡD）识别。用Nothern blot杂交及分析MTP活性表明MTP在肝和肠表达，在卵巢、睾丸和肾也发现有低水平MTp mRNA表达。计算机辅助分析转录起始点上游743bp序列表明，他与几种已知顺式作用元件同源，可调节MTP组织特性性表达。在转录起始点第一个200bp序列含肝特异C/EBP、HNF-1和HNF-5转录因子识别的上游启动子元件，该区还含有通用转录因子Sp-1和Ap-1识别序列。Sp-1，C/EBP、HNF-1和HNF-5在该区的位点有单个碱基错配。其他比第一个200bp更上游的顺式元件可被HNF-5，C/EBP和CTF/NF-1识别。

MTP大亚基限制性片段长度多态性分析或简单序列的串联重复多态性分析，均可用于调查MTP基因与异常血浆脂类或脂蛋白代谢的联系。CA双核苷酸重复多态性在人基因组随处可见，这种重复可用PCR分析，因而是一种理想的基因标记。为了识别CA双核苷酸重复序列，用一个CA重复的探针来与MTP大亚基因进行杂交，在内含子10发现非完整CA重复结构(CA)₄AA(CA)₃GA(CA)₄TA(CA)_nTACA,分析18个不相关个体的36个等位基因表明有8种变异，n从8到17。荧光原位杂交表明MTP大亚基基因位于4号染色体，即4q²⁸-q³¹。

三、MTP生理功能和基因突变

脂质转运蛋白促进膜间不溶性脂类分子转运，MTP的特性在于他剌激膜间中性脂类（甘油三酯、胆固醇酯、磷脂酰胆碱）转运。脂质转运蛋白也能促进膜间脂质分子交换或促进从一种膜向另一种膜净转运脂质分子，虽然有例外，但在体外分析表明脂质转运蛋白一般是促进膜间脂质分子交换。当供体和受体膜间TG浓度相等时，MTP能促进膜间交换TG，而且当供体和受体膜间中性脂类浓度不平衡，中性脂类仍可转移到受体颗粒，表明MTP能净转运TG和CE。MTP存在于肝细胞和小肠细胞微粒体腔内，在富含甘油三酯的脂蛋白的正常组装、分泌中起有重要作用。用MTP抑制剂研究表明，MTP在含ApoB₄₈脂蛋白组装的早期而不是晚期起作用，光亲和MTP抑制剂能阻断McArdle RH-7777细胞分泌含ApoB的脂蛋白，当这种细胞在缺乏MTP抑制剂和油酸时，贫脂质（HDL）的ApoB₄₈颗粒可以形成，但不能分泌。油酸加入这种培养细胞后可转化成能分泌的富脂质的颗粒。然而，如果在贫脂复合体形成之后加入MTP光亲和抑制剂，则对这种转化或分泌过程没有作用。

1992年Wetterau J.R等报道无β脂蛋白血症患者MTP活性和MTP蛋白缺陷。SharpD.等1993年从一个无β脂蛋白血症患者取小肠活检，该患者是近亲婚配的女性后代，39岁，用RT-PCR结合序列分析表明215位胞嘧啶缺失，导致发生移码突变，移码突变导致在下游21个碱基处过早形成一个终止密码，并预测翻译产物为78个氨基酸。进一步分析发现该患者是移码突变的纯合子。从一个14岁女性无β脂蛋白血症患者发现1783位C→T转换，这个突变使Arg密码变成终止密码，产生594个氨基酸的截短产物。这个无义突变消除了一个TaqⅠ限制性内切酶位点。Southern杂交分析表明该患者为纯合子，而其父母都是含正常和突变的杂合子。为检测这些突变对MTP的影响，将PDI和野生或突变MTP大亚基用杆状病毒表达系统在sfq昆虫细胞共同表达。用表达PDI和野生MTP大亚基病毒共传染sfp细胞，可产生有活性的MTP。相反，用表达PDI和突变MTP大亚基病毒共传染sfq细胞，则不能产生有活性蛋白，突变蛋白也形成不容性凝聚体，不能与PDI结合。该结论可用解释无β脂蛋白血症患者的突变后MTP活性和MTP蛋白的缺陷。到目前为止，MTP大亚基的突变有码突变、无义突变及点突变改变了MTP的正常剪接。

第五节　胆固醇调节组件结合蛋白

胆固醇调节组件结合蛋白（SREBPs），是一类能与胆固醇调节组件1（SRE-1）发生特异性结合的“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”（bHLH-ZZP）蛋白。在细胞内缺乏胆固醇的情况下，SREBPs通过和SRE-1的结合，激活SRE-1的基因，使其翻译增强，发挥生理功能。

一、胆固醇调节组件1的功能和定位

编码低密度脂蛋白受体（LDL-R）的基因5'侧翼区，具有一个长10个碱基对的胆固醇调节组件1（sterol regulatory element 1,SRE-1）。SRE-1是一个条件正性调节组件，仅在细胞内胆固醇缺乏的条件下，才被激活。在其他的胆固醇调节基因如羟甲基戊二酸单酰CoA合酶（HMGCoa synthase ）基因的启动子中也含有SRE-1，而在羟甲基戊二酸单酰CoA还原酶（HMGCoa reductase ）基因的启动子中含有类似于SRE-1的胆固醇调节组件（SRE）。SRE-1通过调节LDL-R基因、HMGCoA合酶基因的翻译，控制细胞对外源性胆固醇的摄取量和内源性胆固醇的合成速率，调节细胞内胆固醇含量。SRE-1在LDL-R基因5'侧翼区的定位见图7-9。

图7-9　+1表示翻译起始位点，T/A表示TATA盒，空心箭头表示重复区，重复区1、重复区3可能和Sp1（一种正性翻译因子）结合。重复区2内含有SRE-1。

二、SREBPs的发现和命名

1989年，Tripathi B.Rajavashisth发现了一种能和SRE结合的锌脂蛋白。1993年，MichaelR.Briggs等人，利用离子交换层析、凝胶过滤和DNA亲和层析的方法，从人类宫颈癌细胞（Hela细胞）核的提取物中分离出了这一组能与SRE-1结合的蛋白质，并将其命名为胆固醇调节组件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs）。SREBPs在细胞胆固醇缺乏的情况下，通过和SRE-1的结合，激活LDLR基因、HMGCoA合酶基因的翻译。

三、SREBPs的结构和分类

SREBPs具有“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”（basic helix-loop-helix-leucine zipper, bHLH-ZIP）结构，是bHLH-ZIP蛋白系列的一种。bHLH-ZIP蛋白包含一系列能特异性地和含E盒（e box, CANNTG）的DNA结合的蛋白质，例如：调节免疫球蛋白基因翻译的TFE_3，致肿瘤蛋白Myc等。SREBPs虽是bHLH-ZIP蛋白中的一种，但又不同于其他的bHLH-ZIP蛋白。一方面，SREBPs分子量大，含1140个左右的氨基酸残基；另一方面，SREBPs不识别E盒（e box）而特定地识别SRE-1中直接重复的“CAC”序列。

迄今为止，发现有两种SREBPs。一种称SREBP-1，另一种称SREBP-2。SREBP-1又由于其mRNA剪接方式的不同，以三种功能上完全相同，组成上略有不同的形式大量存在，这三种形式的蛋白分别称为SREBP-1a、SREBP-1b、SREBP-1c。其中，SREBP-1a是SREBP-1的主要存在形式，故本文以SREBP-1a为例来描述SREBP-1。SREBP-1a含1147个氨基酸残基。分子量为125kD。至今，还没有发现SREBP-2存在多种不同的剪接后蛋白。SREBP-2含1141个氨基酸残基，分子量为121kD，与SREBP-1a之间有47%的同源性，含高度保守的bHLH-ZIP区，和SREBP-1a的bHLH-ZIP区有71%的一致性。但是SREBP-2含有不同SREBP-1a的谷氨酸富集区（在121个氨基酸残基中含多于27%的谷氨酸残基。SREBP-1a和SREBP-2的氨基酸序列和功能域结构之间的比较参见图7-10（A、B、C）。

图7-10 A：SREBP-2和SREBP-1a氨基酸序列之间的比较

“--”表示二者的相同部分

图7-10 B：SREBP-2和SREBP-1a的bHLH区（粗横线所示）的比较

四、SREBPs的生理功能

两种SREBPs利用位于其氨基酸残基470～570之间的疏水序列，附着于内质网膜和核膜，在氨基端的470个氨基酸残基组成的肽链中，均含“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”的核心结构，使蛋白质能形成均一二聚体，并能和SRE-1结合。两种蛋白质氨基端一侧的结构中，都有酸性区域，可能作为DNA翻译的增强子。当人或仓鼠细胞在缺乏胆固醇的环境中培养时，蛋白酶在亮氨酸拉链和膜间的附着区处裂解SREBPs，并从膜上释放出水溶性的氨基端的裂解片段，这一片段约含470个氨基酸残基，表现分子量为68kD。这一片段能够移行入胞核，结合于SRE-1，从而激活LDLR基因翻译和HMGCoA合酶基因翻译。

SREBPs裂解、移行入胞核，进而结合于SRE-1，以致激活LDLR基因、HMGCoA合酶基因，都有赖于细胞内缺乏胆固醇。因为胆固醇能够抑制SREBPs的裂解。而已形成的SREBPs的裂解片段又很容易被迅速分解，从细胞核中快速消失。故而胆固醇的存在，将阻断整个调节通路，使SRE-1失活。

将SREBP-1和SREBP-2进行cDNAg隆，并采用质粒转染动物细胞的方法，使培养细胞，如Hela细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞），表达SREBP-1和SREBP-2，发现他们调节细胞内胆固醇代谢的过程是一致的，功能上是协同的，然而两种蛋白质是单独发生作用，没有发现杂化二聚体。为什么存在这两种组成不同但功能一致的SREBPs，原因还不清楚。

研究仓鼠肝脏中产生的，由细胞内胆固醇含量调节的mRNA（包括LDLR和HMGCoA合酶的mRNA）的含量。肝脏经HMGCoA还原酶抑制物mevinolin处理后，这两种mRNA的量都增加。通过阻止胆固醇的合成，mevinolin诱导暂时的胆固醇水平降低，而增强胆固醇调节基因的翻译。当mevinolin和胆汁酸结合树酯，如降胆灵合用时，mevinolin增强翻译的效果更强。降胆宁通过阻止肠道对胆汁酸的再吸收，使胆固醇转变为胆汁酸，因而增加肝脏对胆固醇的进一步需求。

最近，研究HMGCoA还原酶抑制物和胆汁酸结合树酯是否促进SREBP-1和SREBP-2在仓鼠肝脏中的蛋白裂解，与在培养的细胞中的发现有些不同。资料表明SREBP-1和SREBP-2的裂解片段在仓鼠肝脏中的调节作用是不一致的。仓鼠肝脏经mevinolin 加降胆宁处理后，SREBP-2的裂解片段增多，而SREBP-1的裂解片段减少。这一结果似乎表明在仓鼠肝脏中，SREBP-1对LDLR和HMGCoA合酶基因的基础翻译起作用，而SREBP-2对经胆汁酸结合树酯和胆固醇还原酶抑制物处理后，形成的胆固醇缺乏状态的基因翻译起作用。

另有报道，胰岛素和类胰岛素生长因子Ⅰ也可以通过SREBP-1介导LDL-R启动子的激活，从而调节细胞内的胆固醇含量。

总之，在细胞内胆固醇含量的自我平衡中，SREBPs起了重要作用，其详细机制的阐明，必然对胆固醇代谢调节的研究产生重大影响。

（董学梅 滕思勇 郑芳 崔天盆）

（脂类代谢有关的特殊蛋白质）参考文献

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第八章　脂蛋白代谢

脂蛋白是血液中脂质的运输形式，与细胞膜受体结合被摄入胞内进行代谢。

第一节　乳糜微粒代谢

CM是饮食高脂肪食物后，由肠壁细胞合成的富含TG的巨大脂蛋白，其直径为80～1000nm，在血液中的半寿期为10～15min，进食后12h内，正常人血中几乎无CM。它是在肠上皮细胞合成并分泌入淋巴管。CM含有ApoⅠ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、和B₄₈。ApoB₄₈含量多少与摄取食物的TG含量有关。ApoB₄₈是合成CM所必须的蛋白质。CM从胸导管移行入血液过程中，其载脂蛋白的组份迅速改变。CM获得ApoC和E，把ApoAⅠ，移行到HDL，脱去ApoAⅣ。进入血中的CM，被末稍血管内皮细胞表面的LPL经ApoCⅡ激活并作用于其内的TG，分解变成脂肪酸和单甘油，脂肪酸再进入肌肉、脂肪组织及心肌组织贮存或利用。CM表面的磷脂和载脂蛋白往HDL₃移行，CM颗粒变小，结果转变成CM残粒，分别被肝脏LDL受体和清道夫受体识别并摄取。

CM生理功能是转运外源性脂类，主要是甘油三脂。其中TG在毛细血管里被水解成游离脂肪酸后进入各组织贮存或利用；而外源性胆固醇则全部进入肝脏，如图8-1所示。

图8-1 乳糜微粒代谢

第二节　极低密度脂蛋白代谢

VLDL大小为30～80nm，含有甘油三酯，胆固醇、胆固醇酯和磷脂等脂类，其中TG占50%左右，蛋白质部分为ApoAⅠ，AⅣ，B₁₀₀，C，E等。VLDL在肝脏合成，利用来自脂库的脂肪酸作为合成材料，其中胆固醇来自CM残粒及肝脏自身合成的部分。ApoB₁₀₀全部由肝脏合成。肝脏合成的VLDL分泌入门静脉进入血液，由LPL水解其内的TG。HDL由来的胆固醇经LCAT作用生成的胆固醇酯，再经CETP转移给VLDL进行交换，而VLDL中余下的磷脂、ApoE、C转移给HDL，VLDL则转变成VLDL残粒，尔后大部分通过VLDL受体摄入肝脏，小部分则转变成LDL继续进行代谢。

第三节　低密度脂蛋白代谢

LDL是富含胆固醇的脂蛋白，其胆固醇主要来自从LTP转运的高密度脂蛋白中的胆固醇。目前认为血浆中LDL的来源有两条途径：主要途径是由VLDL异化代谢转变而来；次要途径是经肝脏合成后直接分泌到血液中。

LDL的降解是经LDL受体途径进行代谢。细胞膜表面的被覆陷窝是LDL受体存在的部位，即LDL的ApoB₁₀₀被受体识别，将LDL结合到受体陷窝内，其后再与膜分离形成内吞泡。内吞泡内经膜H⁺-ATPase作用下，pH降低变酸，LDL与受体分离后又与溶酶体融合，再经酶水解产生的胆固醇进入运输小泡体，经ACAT作用再酯化而蓄积。血浆中65%～70%的LDL是依赖LDL受体清除，少部分（约1/3）被周围组织（包括血管壁）摄取异化。胆固醇能促进ACAT活性增加，与此同时，因胆固醇的增加使合成胆固醇的HMGCoA还原酶和HMGCoA合成酶等活性被抑制，LDL受体自身转录被抑制，胆固醇的合成减少或摄入进入细胞内的量也减少，胞内胆固醇降低。一旦LDL受体缺陷，VLDL残粒由正常时的大部分经肝LDL受体识别，而改为大部分转变成LDL，使血浆中LDL浓度增加。

第四节　高密度脂蛋白代谢

HDL主要由肝脏和小肠合成。肝脏合成的新生HDL以磷脂和ApoAⅠ为主。在LCAT作用下，游离胆固醇变成胆固醇酯，脂蛋白则变成成熟球形HDL₃’，再经LPL作用转变成HDL₂。

HDL可将蓄积于末稍组织的游离胆固醇与血循环中的脂蛋白或某些大分子结合而运送到各组织细胞，主要是肝脏，这种胆固醇被利用的过程称为胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport, RCT）。RCT促进组织细胞内胆固醇的清除，维持细胞内胆固醇量的相对恒定，从而限制动脉粥样硬化的发生发展，起有抗动脉粥样硬化的作用。Glomest指出，LCAT通过转酯化反应完成新生盘状HDL向HDL₃、HDL₂的转化，减少血浆HDL中游离胆固醇的浓度，构成胆固醇从细胞膜流向血浆脂蛋白的浓度梯度，降低组织胆固醇的沉积，如图8-2所示。

图8-2 高密度脂蛋白代谢

图中虚线为脂肪的转移途径，实线为载脂蛋白转移途径

LDL-R：LDL受体，ApoE-R：ApoE受体，HDL-R：HDL受体

第五节　脂蛋白代谢主要途径

脂蛋白代谢主要途径如图8-3所示。作为食物中的脂质有甘油三酯，胆固醇等，以TG为主。TG经胰脂肪酶水解后，经肠道吸收于肠粘膜细胞内再合成TG（外源TG），同时还有Ch、PL、ApoAⅣ、B₄₈与之结合形成CM，进入淋巴管由胸导管再送到血液（图中1）。流入血液中的CM，从HDL接受ApoC-Ⅱ，E及CE（图中2），各脏器毛细血管内皮细胞表面的LPL被ApoC-Ⅱ活化后，水解CM的TG，（图中3），使之转变成仅有ApoB₄₈和ApoE为主的CM残粒，被肝细胞的ApoB、E受体识别并摄取入肝细胞（图中4）。CM在血液中半寿期为5～15min，空腹时，血中一般无CM存在。

另外，体内肝脏利用糖及游离脂肪酸合成TG（内源性TG），再与Ch，ApoB₁₀₀、ApoC-Ⅱ及ApoE等结合形成VLDL释放入血中（图中5）。血中VLDL，再接受HDL上转移的ApoC-Ⅱ、E（图中6）又在各组织毛细胞血管壁的LPL作用下，使其核心的TG不断水解（图中7），尔后转变成中间密度脂蛋白（IDL）或者称为VLDL残粒，大部分被肝脏摄取，也可能被肝外脏器摄取一小部分。血浆中VLDL很不均一。大颗粒的含TG高者可迅速清除，仅10%左右转变成LDL；小颗粒含TG较少的VLDL清除较慢，约40%转变成VLDL残粒，经肝细胞的LDL受体摄取（图中8）；一部分又经LPL和HL作用水解TG成脂肪酸供组织细胞利用，等其表面积缩小，并变成ApoB₁₀₀为主的LDL。LDL一部分经肝脏LDL受体识别摄取入肝脏（图中9）；另一部分氧化后经肝及肝外组织清道夫受体识别入肝外组织细胞（图中10）。

HDL是肝脏（图中11）和小肠中（图中12）合成的一种脂蛋白，具有从末稍组织运送Ch到肝脏处理的生理功能。LCAT使卵磷脂的FFA转移到Ch上催化进行胆固醇酯化反应，HDL是其最适底物。刚合成分泌的HDL为新生HDL，呈圆形，含ApoE多，经LCAT作用转变成球状HDL₃（图中13），又再转变成HDL₂（图中14）。粘膜细胞也合成一部分新生HDL（图中10），HDL还可能将ApoCⅡ和ApoE转运给CM及VLDL。

脂蛋白代谢是血中脂质、脂蛋白、载脂蛋白及其受体、蛋白因子和酶相互作用并密切联系的相关代谢过程。在脂蛋白代谢过程中许多环节易出现代谢受到障碍，从而有可能导致脂蛋白代谢紊乱。

图8-3 脂蛋白的主要代谢途径示意图

Ⅰ-Ⅳ为高脂蛋白血症发生的代谢环节；○内的数字为代谢环节标记

（涂建成）

（脂蛋白代谢）参考文献

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第九章　自由基与细胞凋亡

第一节　大气氧含量的变迁

大气氧含量的变迁为生命的起源及生存创造了必须的条件。

生命的起源，历史上记录了许多企图回答这个古老的问题的答案，最具代表性的理论有三种：①特创论；②迁居论；③自然发生论。第一种解释特创论是生命起源归因于超自然力量的干预。圣经的《创世记》篇中关于创造世界的叙述就是特创论的一个例子这种理论显然是缺乏科学依据的。第二种解释是迁居论，迁居论假设认为，我位今天在地球看到的生命起源于从宇宙的另外地方的生命类型。这一假说远在19世纪经瑞典化学家Srante Arrhenius最先提出。按迁居论者认为，我们今天在地球上看到的生命。可能代表漫不经心地丢弃在垃圾里的细菌的后裔，这垃圾则是几十亿年以前从别的世界来的旅游者，在我们称之为太阳的恒星外数第三的行星（指地球）上停留期间进行野餐时遗留下来的，这种假想确实带有神话的色彩。目前的登月飞行，寻找外星有否生命存在，与迁居说有否联系，不得而知。第三种自然发生论是人们最感兴趣而有一定科学依据的假设。1924年Oparin提出生命起源于无生命物质。然而，生命的起源并不是一个能够追踪到特定的顷刻时间的突然事件。而是发生于地球上的一个经历了难以想像的漫长时间的逐渐的演变过程。Oparin和Haldane的化学进化假说新依据的设想是在适宜环境的影响下，所有这些重要的有机分子是可以形成的，并且随着时间的推移，这些分子就会发生一系列的相互作用，最后形成生命体系。当时这种假设并未被科学界马上接受，直至1953年，Stanley Miller利用自行设计的装置重建了含有甲烷、氨和水的原始地球大气，并加热到121℃（水在100℃时煮沸）24h灭菌，无菌之后，通过实验装置上部钟罩内包含的大气进行火花放电，经过七天之后，停止放电并分析实验装置中的内含物，以确定是否有有机化合物产生。七天后，在烧瓶内发现了许多象征生命系统特征的分子，有四种不同的氨基酸，尿素及其他化合物，在Miller的先驱性实验工作之后的年代中，别的实验工作在模拟原始地球的条件下，完成了不仅是简单的有机化合物，而且是更加复杂的分子生命系统中发现的原白质和核酸颇为相似。科学家们对Oparin-Haldane的生命起源假说是很认真的，他们的观点是把地球上生命的发展看作是特续达亿万年之久的化学进化过程的结果，这种观点是对生命起源的比较合理的解释。Oparin-Haldne学说的最重要的前提大气中氧气含量的变迁，为生命的起源创造了不可缺少的条件。正因为大气中氧含量经过亿万年的变迁，才进化到构成今日大气之大部分的氮气和维持生命的氧气，仅仅是原始地球大气的次要成分。因为原始地球表面是一个不毛之地的世界，它具有现在截然不同的的大气，有丰富的热能来源，它沐浴在紫外光之中，而且经受着当今世界所无法匹敌的巨大电暴。

地球上的生物在进化过程中，最初经化学进化合成简单有机物，如CH₄、HCN及HCHO，从而演化产生厌氧生物。继之产生光合生物，它们利用这些有机物，并借助太阳能固定二氧化碳；其后又出现了篮藻，它是以水作为电子供体，进行光合作用生成氧的生物。篮藻使水受光氧化，造成地球大气O₂的最初蓄积（图9-1）。在这之前，原始地球的大气成分中无游离O₂，却含有具还原性的氢。这种环境变化，即游离O₂作为光合作用副产品的不断产生，造成一种危机：生物只有逐步适应此含氧的大气才能生存，对于当时的原始生物来说，进入大气中的氧分子是一种“公害”，它使厌氧生物的生活圈逐渐限制在很狭小的范围，其巢穴越来越小。同时，因O₂蓄积，形成臭氧层，290nm以下的紫外线不能到达地表，导致进入地表的能量减少，造成生物损害。结果，生活在深水中的生物生活圈必须扩大，从接近水面进而迁移到陆地，促进了对O₂有抵抗性的生物的大发展。

图9-1 地球大气氧浓度的变迁

光合作用导致大气中大量蓄积O₂，它不仅对厌氧生物，而且对需氧生物亦显示毒性。需氧生物不仅利用氧的过程中获得对付O₂毒性的防御机能。而且还能把O₂作为电子受体加以利用，获得高效率能源，使进行氧呼吸的需氧生物进化了一大步。氧气对生物的进化及生存是如此的重要，然而氧气也有对机损害的一面。主要通过氧自由基对机产生多种有利和有害的影响。

第二节　自由基的来源

一、概念

大多数化学键由双电子形成。这种键断裂时有二种可能：一种是异裂反应，成键的两个电子分给两种分裂产物之一，生成物为离子。另一种是均裂反应，两个电子均分给两个产物，此过程中产生的分裂物称为自由基（free-radical），在溶液中呈均一状态。自由基是指分子、原子或基团中有未配对电子的一类物质，如下述反应中的A·和B·，还有NO、NO₂、I·及Na·等均具有未配对电子。绝大多数自由基寿命短，生成后不稳定，易被周围环境吸收。在化学反应机理的研究中，发现自由基参与的反应占相当大比例。

二、自由基的来源

机体在代谢中不断地产生自由基，在酶催化的电子转移及氧化还原反应中，有许多自由基中间体参与；某些药物在体内以自由基中间体的活性形式发挥作用；在光化学反应及放射中多以自由基发挥作用。生物体的自由基可通过下面几种方式产生。

（一）放射线照射

放射性可直接或间接地对生物体发生作用，α-射线具有高能粒子作用，γ-射线具有电磁波作用，使生物体组织成分的分子激励或离子化；最终是化学键被切生成自由基，使机体被损害，这是放射线对生物直接作用的结果，这种方式是少量的。生物体内含有大量水，放射线首先使水分解，产生反应性非常高的自由基如H·和·OH等，H·和·OH可产生多种效应如破坏机体各组织细胞等，这是放射线对生物间接作用的结果。

生物体还被外部宇宙线、伦琴射线以及β射线包围，使生物体沐浴在大量射线之中，因而组织易遭损伤，加快老化的过程。

（二）机体周围自由基前身物的转变

我们周围环境有各种自由基或产生自由基的多种物质存在，如较稳定的氮氧化合物NO、NO₂自由基，在大气中还有汽车排出的碳化氢，空气烟雾中的氟利昂等经太阳紫外线照射及光分解产生多种碳的自由基及卤原子；大气中的臭氧也可能转变成过氧化物自由基。食物中某些成分如茶叶在空气中放置过久，自由基含量会升高，还有一些脂类含有自由基的前身物以及过氧化物、某些药物、激素和类固醇等经机体摄取后，在代谢过程中也容易产生自由基。

（三）生物体内活性氧的生成

机体在代谢中不断产生的自由基，种类繁多，其中以活性氧最多。

1．活性氧种类：氧是偶电分子，分子中存在一个σ键和两个三电子π键，其简化结构式为。O₂可呈现两种状态，即单线态（singlet state）又称为激发态，以¹O₂表示；另一种为三线态（triplet state），又称为基态，以³O₂表示，³O₂可吸收能量变为激发态；

³O₂+hυ→¹O₂

氧化能力的指标是以氧分子的还原分子之间的标准氧化还原电位（E¹）而定，如图9-1所示。

图9-2 氧分子及活性氧相互间的标准氧化还原电位（pH7.0）O:1.0Atm

图9-3 脂质过氧化反应及其脂质自由基的生成（LOOH、LOO、LO·）

氧是一个重要的电子受体，因所得电子数不同，氧可产生多种还原产物：O₂^-、·OH及H₂O₂，他们的E¹均比O₂高，具有强的氧化能力。

O₂+e→O₂^-

O₂+2e+2H⁺→H₂O₂

O₂+3e+3H⁺→·OH+H₂O

O₂+4e+4H⁺→2H₂O

不饱和脂肪酸在¹O₂等作用下，被氧化成过氧化脂（LOOH），LOOH又可进一步使脂肪酸氧化，脂质过氧化反应及其脂质自由基的生成如图9-3示。

以上所述的¹O₂、O₂^-、H₂O₂、·OH及LOOH等统称为活性氧，但是体内不能产生活性的O₂⁺及原子氧。

基态氧本身毒性很低，但是O₂^-、H₂O₂、·OH、¹O₂及LOOH毒性较大，这种活性氧的毒害作用称为氧的毒性。

2．活性氧的生成性质

（1）超氧化物自由基（O₂^-）：O₂^-也可以HO₂形式存在，HO₂的pKa为8.4，在生理pH为7.45条件下，大部分以O₂^-形成存在，即HO₂

H⁺+O₂^-。O₂^-是O₂被一个电子还原生成，再由O₂^-产生其它活性氧，O₂^-是造成氧毒性的主要物质，在pH7.0时，O₂^-/O₂和（2H⁺、O₂^-）/H₂O₂的E¹相应为-330毫伏和+940毫伏，O₂^-既可起氧化作用，也可作为还原剂，当O₂^-作为还原剂时，产物为H₂O₂。

O₂^-的消除主要经超氧化物歧化酶（SOD）催化生成O₂和H₂O₂：

k=2.37×10⁹M^-1S^-1,O₂^-也可自身进行歧化反应，反应速度相当慢：

H₂O₂与O₂^-反应可生成反应性更高的HO·及¹O₂：

O₂^-可被维生素C还原生成H₂O₂，维生素C使O₂^-还原的速度常数为2.7×10⁹M^-1S^-1，与SOD催化的反应速度常数相当，细胞内维生素C浓度高，因此维生素C有与SOD同等程度消除O₂^-的作用。O₂^-还可被维生素E及谷胱甘肽（GSH）还原生成H₂O₂，GSH的-SH还原作用约相当于SOD的10%。

由于O₂^-寿命短，检测有一定困难，只能用电子顺磁共振波谱（ERR）检出。

（2）过氧化氢（H₂O₂）：H₂O₂可由O₂^-的歧化反应生成，在D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶及亚硫酸盐氧化酶等作用下，把O₂作为电子受体，经两个电子还原生成H₂O₂，在线粒体中也能直接生成H₂O₂。H₂O经放射线照射，一次生成·OH，再生成H₂O₂。

H₂O₂较稳定，反应性低，在体内浓度也比较低，（大鼠肝脏中为10^-9M），对机体几乎无毒性；H₂O₂可与铁离子生成反应性非常高的·OH：

H₂O₂+Fe²⁺+H⁺→OH+Fe³⁺+H₂O

H₂O₂的消除依赖于两种酶，一是过氧化氢酶，催化H₂O₂歧化反应：2H₂O₂→2H₂O+O₂；二是谷胱甘肽过氧化物酶。在GSH参与下使H₂O₂分解，GSH则变成氧化型谷胱甘肽。这两种酶可消除体内H₂O₂及过氧化物，防止血红蛋白及肝细胞膜部分被氧化破坏的可能。

（3）氢氧自由基（·OH）：体内·OH从O₂直接生成的反应尚不清楚，机体可由O₂^-生成系与H₂O₂生成系共同形成·OH自由基。水经放射线照射后的一级反应产物是·OH，由于·OH氧化能力很强，因此对机体毒性很大。

H₂O₂+Fe²⁺+H⁺→OH+Fe³⁺+H₂O

H₂O₂+O₂^-+H⁺→·OH+H₂O+O₂^-

·OH在水中寿命很短，一般不易以自旋共振（ESR）方法检出，有人利用DMPO（5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）作自旋捕获，成功地检出白细胞内产生的·OH，因DMPO与·OH形成一个较稳定的加成物DMPO-HO·。另外也可采用生物反应检出。

（4）单线态分子氧（¹O₂）：¹O₂是一个强的亲电子性的氧化剂，可用化学方法生成，也可由H₂O₂经氧化生成，即H₂O₂由次氯酸氧化生成¹O₂：

NaClO+H₂O₂→¹O₂+NaCl+H₂O₂

¹O₂可与芳香族碳氢化合物进行一系列的反应。

¹O₂可将能量转移给其他物质而变成³O₂，在此过程中，物质（A）作为¹O₂的淬灭剂，接受能量变为激发态（A^*），然后以热的形式放出能量回到基态A。水也可作为¹O₂的淬灭剂。

由于¹O₂在水中寿命短，要检测出¹O₂有一定困难，最直接的证明是经¹O₂→³O₂+hυ的化学发光观察，¹O₂单分子发光波长为1269微米及760微米。¹O₂的寿命在D₂O中比在水中长10倍，以此均可证明¹O₂的存在。最近有人利用光子计数器检测微粒体中产生的¹O₂已获得成功。

（5）过氧化脂类：人体内主要有亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸，多以磷脂形式存在于质膜等生物膜中。这些不饱和脂肪酸可受¹O₂氧化，也可经·OH氧化生成过氧化脂质，生物膜上脂类既可在O₂^-作用下生成过氧化脂质（LO·、LOO·、LOOH），也可经放射线照射生成脂类自由基（L·），这种在脂类中微量存在的L·，在氧参与下进行链锁反应，加速过氧化过程，如图9-3所示。过氧化脂质化学性质活泼，易进一步使脂类分解引起自由基反应，也可使GSH氧化，而本身变成较稳定的脂类羟基化合物（LOOH）。

氧自由基的生成、氧化还原及激发过程如图9-4所示。

第三节　由基的防御作用

生物体内具有防御自由基毒害的抗氧化剂或抗氧化酶。

一、超氧化物歧化酶作用

SOD是催化O₂^-歧化反应的酶类，这种歧化反应属于自身氧化还原反应，O₂^-的歧化反应在H^-存在下，经SOD催化，一半O₂^-氧化为O₂，O₂^-的另一半还原为O₂^2-。

SOD+O₂^-→SOD^-+O₂

SOD^-+O₂^-+2H⁺→SOD+H₂O₂

（SOD：氧化型，SOD^-：还原型）

SOD是生物对抗O₂^-毒性的酶，产物之一H₂O₂又可与O₂^-相互作用（Haber-Weins反应）产生OH·，借以清除细胞内O₂^-。缺氧条件下，培养的大肠杆菌里SOD含量少；有氧条件下，培养的大肠杆菌里SOD含量高。如果将上述两种大肠杆菌置于20个大气压的O₂及N₂条件下培养，当即见到无O₂条件下预先培养的大肠杆菌迅速死亡；有O₂条件下，预先培养的大肠杆菌对O₂有抵抗性，因此，SOD在防止O₂^-的毒性方面具有重要意义。

SOD有含Cu、Zn的SOD（Cu、Zn-SOD），含Fe的SOD（Fe-SOD）及含Mn的SOD（MnSOD）三种存在形式。生物界中，细菌等原核生物及线粒体含有Fe-SOD和Mn-SOD，与高等动物所含的Cu、Zn-SOD相比，其蛋白质部分截然不同。目前从牛红细胞中提取了比较多的Cu、Zn-SOD，其结晶纯品已开始用于临床。各种SOD进行的歧化反应稍有不同，Fielden等测出Cu、Zn-SOD中的Cu有1/4处于还原不被氧化状态，这是因为有一部分Cu与O₂^-进行反应，另一部分处于非反应状态。

Pick等测出大肠杆菌的Mn-SOD对O₂¹的催化反应有两种速度，推测Mn-SOD以三种形式存在并参与反应。

Fe-SOD参与反应的机制与Cu、Zn-SOD一样按两步进行：

SOD生理功能可归纳为：保护细胞，对抗氧的毒性；有助于H₂O₂浓度的调节，对付微生物的侵害。

二、维生素E的作用

维生素E又名生育酚，天然的生育酚有七种，其中分布最广泛的是α-生育粉，具有抗氧化作用。维生素E可抑制肝细胞内微粒体的过氧化脂类的生成。据报道，给予鼠维生素E有延长寿命的作用，在胎儿成纤维细胞传代培养中，给予维生素E者，传代数增加，可抑制过氧化脂类生成，其原因是作为生物体内自由基淬灭自由基（LOO·）生成的苯羟自由基的过程可被巯基化合物还原，特别是被GSH还原成生育酚，从而使生育酚能更有效的发挥作用。

维生素C也有与维生素E同样的作用，然而维生素E是脂容性，维生素C是水溶性，基作用场所不同，维生素C可使水中自由基淬灭，在防止膜受攻击上有重要意义。

三、过氧化氢酶、过氧化物酶的作用

体内H₂O₂可被氧化酶和氧化物酶转变为H₂O₂消除H₂O₂的毒性。过氧化氢酶可催化两两分子H₂O₂生成H₂O₂和O₂过氧化物酶利用H₂O₂直接胺类等物质，某些组织中含有一种含硒的谷胱氧化酶，可使LOOH或H₂O₂与GSH反应将LOOH变成无毒的醇类。

活性氧的代谢途径及清除体系如图9-5所示。

图9-5 活性氧的代谢途径及清除体系

←：活性生成反应；□：活性氧；：清除酶系；AH：清除低分子化合物；AH：电子供体

第四节　氧化低密度脂蛋白

天然的低密度脂蛋白（LDL）经氧化修饰形成的脂蛋白，称为氧化低密度脂蛋白（OxLDL）。天然LDL核心的脂肪酸中含有大量不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFAs）约占LDL总脂肪酸含量的35%～70%，所以容易发生自身氧化。

LDL中的PUFAs在自由基或其他氧化剂作用下，生成脂类自由基，并能产生更多的过氧化脂质，引起连锁的自由基链式反应，最终生成多种反应性的醛。这些化学性质活泼的醛和ApoB发生结合，产生新的抗原决定簇，形成氧化LDL。OxLDL与动脉粥样硬化关系密切。

一、修饰的LDL与巨噬细胞泡沫化

从动脉粥样硬化发病机制，我们不难发现LDL在动脉粥样硬化发生、发展中起非常重要的作用。

（一）内皮细胞俘获LDL和巨噬细胞泡沫化

高脂血症、脂质代谢失常是动脉粥样硬化的重要病因。血浆中增多的脂质以LDL的形式经完整的内膜侵入内皮下，这一过程呈现LDL浓度依赖性，无需受体介导。另有观点认为，机械因子、化学因子、免疫因子、毒素或感染因子对内皮的损伤，导致LDL-胆固醇摄取增多。这又反过来会改变内皮细胞和循环血细胞（单核细胞、血小板）的表面特性，促进单核细胞粘附于血管内皮，并转变为巨噬细胞，转变后的巨噬细胞更有能力摄取更多的脂质，在内皮下被俘获的天然的LDL可以经历两种形式的修饰，即衍化和氧化，如图9-6所示。

图9-6 LDL的修饰在内皮下间隙，被俘获的天然的LDL可能经历两种形式的修饰-衍化（MAD粘附于ApoB-100或者ApoB-100的糖基化）、氧化（ApoB-100被过氧化物降解），分别形成衍化的LDL和氧化的LDL。

天然LDL在正常情况下，由LDL受体识别。LDL和LDL受体结合后，内吞入细胞，与溶酶体结合。在溶酶体酶的作用下，蛋白质降解为氨基酸，胆固醇酯水解为游离胆固醇和脂肪酸。此受体受到细胞内胆固醇含量的下降调节，当细胞内胆固醇的含量增多时，LDL受体的量便会减少。所以，天然LDL经这一途径代谢，不会引起胆固醇酯在细胞内堆积。

LDL还可以通过清道夫受体途径代谢。这一受体主要参与修饰的LDL的代谢，没有下降调节的特点，不受细胞内胆固醇的含量的应答。通过此途径，修饰LDL被摄取和降解的速度都比正常LDL快。所以LDL这一代谢途径直接参与动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成，如图9-7所示。

图9-7 泡沫细胞的形成巨噬细胞通过修饰LDL受体途径摄取（消化）修饰的LDL。导致大量的负荷脂质的小滴进入，泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化进程中脂肪纹形成的标志。

（二）LDL的氧化修饰

1．LDL氧化修饰的形式

（1）细胞介导的LDL氧化修饰

1981年，Henriksen等人将兔主动脉内皮细胞和LDL孵育一段时间后，发现该LDL被巨噬细胞摄取的速度较未与内皮细胞共同孵育的LDL快，而且在孵育的基质中发现了硫代巴比妥酸反应物（TBARS），据此，认为内皮细胞可以氧化修饰LDL。这是细胞介导的LDL氧化修饰，又称生物氧化修饰的LDL。后来发现除内皮细胞外，巨噬细胞、血管内膜平滑肌细胞、单核细胞都可以氧化修饰LDL。

（2）过度金属离子介导的LDL氧化修饰

过度金属离子Ca2+、Fe²⁺等，在体外适宜条件下与LDL孵育一段时间后，也能使LDL发生氧化变构。因为这是利用化学物质氧化LDL，故称为化学氧化修饰的LDL。

（3）其他形式的氧化修饰

还可以使用物理学方法如紫外线、钴60对LDL进行氧化修饰。利用过氧化酶类也可能使LDL转变成OxLDL。

2．氧化修饰的过程

LDL的氧化可人为划分为三个阶段。最初为迟滞阶段，消耗内源性抗氧化剂（VitE）；增殖阶段，PUFAs快速氧化为脂质氢过氧化物；分解阶段，脂质氢过氧化物转变为反庆性的醛。这些醛包括丙二醛（MDA）、4-羟烯酸（4-HNE）等，并可以和ApoB发生共价结合（主要和ApoB的赖氨酸残基结合），形成新的抗原决定簇。OxLDL丧失与天然LDL受体结合的能力，被清道夫受体所识别。

3．氧化修饰后LDL理化的生物学特性

OxLDL不同于天然LDL。OxLDL内维生素E含量下降，游离氨基减少，琼脂糖电泳速率增快。LDL中所含的大量卵磷脂转变为溶血卵磷脂。氧化修饰程度低时，ApoB以分解为主。修饰程度高时，降解的ApoB又可重新聚合成大分子。氧化LDL还具有一系列生物学毒性作用。氧化修饰后的LDL不能经LDL受体代谢，由清道夫受体识别、结合、内吞饮入细胞并丧失正常的胆固醇代谢途径，引起细胞内脂质沉积，泡沫样变。

4．修饰的LDL和氧化修饰的LDL的区别和联系

氧化的LDL是修饰LDL中的一类。修饰的LDL除包括氧化修饰的LDL外，还包括乙酰化LDL及丙二醛、4-羟烯酸直接结合的LDL，我们称这些未经氧化修饰，而仅经一般化学修饰的LDL为衍化的LDL。

衍化的LDL和OxLDL都可以被清道夫受体识别，导致泡沫细胞的形成。在过去的很长一段时间里，我们将一般化学修饰的衍化的LDL和OxLDL混为一谈。特别是认为氧化LDL就是MDA-LDL。但实际上，MDA-LDL不同于OxLDL。

用Ca²⁺引发LDL的氧化修饰，比较氧化修饰的LDL与脂质过氧化降解产物MDA修饰的LDL之间的差别。发现氧化修饰LDL和MDA修饰LDL都产生类似于脂褐质的荧光物质，都可使LDL上的游离氨基减少，琼脂糖电泳速度加快，且游离氨基减少量与电泳迁移率增加呈正相关。但两类不同的修饰LDL之间也有差异,主要表现在：①对细胞生理功能影响不同。氧化LDL可诱发细胞毒性作用，影响花生四烯酸的代谢，抑制胆固醇酯化作用等，而一般化学修饰的LDL则无上述效应；②氧化修饰消耗LDL内源性抗氧化物质，使LDL上的维生素E含量下降，而MDA修饰无上述改变；③氧化修饰涉及脂质过氧化反应，LDL中的PUFAs被氧化。MDA对LDL修饰，是直接和ApoB-100结合成希夫氏碱，脂质过氧化反应轻微；④氧化LDL在氧化程度低时，ApoB降解，在氧化程度高时，ApoB又可发生再聚合。MDA对LDL的修饰，ApoB无降解、聚合反应发生；⑤氧化LDL产生的荧光峰波长为430nm，而MDA修饰LDL的荧光峰波长为460nm。这些差异可能是由于两类不同的修饰对LDL结构与组成影响不同，提示我们不能简单地把脂质过氧化降解产物修饰的LDL等同于OxLDL。

二、氧化LDL的代谢

OxLDL由清道夫受体识别并进一步代谢。清道夫受体可能是多种受体的总称，据报道，除乙酰化LDL的受体外，Fcr受体和CD₃₆受体也能介导OxLDL的摄取和降解。现已证实分离纯化的清道夫受体是由3个λkD的亚单位构成的糖蛋白，存在于细胞表面，聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为2.2×10⁵左右。清道夫受体可以和乙酰化LDL、OxLDL以及诸如次黄嘌呤核苷酸、丝氨酸磷脂等配体结合。这些物质的共同特点为多阴离子化合物。正常LDL受体是通过识别ApoB上由赖氨酸、精氨酸、组氨酸共同构成的正电荷区与LDL结合的。LDL氧化后，产生的反应性醛和LDL的ApoB的赖氨酸残基的ε氨基结合，使LDL失去一些正电荷，带上多量负电荷。这样OxLDL不能再被LDL受体识别，而被清道夫受体结合。而且OxLDL摄入速度是天然LDL的3～10倍，并且不受细胞内胆固醇含量的应答。

巨噬细胞和内皮细胞对不同氧化程度的LDL的结合和降解量是不同的。总的来说，随着氧化修饰程度的升高，巨噬细胞和内皮细胞对LDL的结合和降解随之升高。将LDL与Ca²⁺孵育，LDL经氧化后得到琼脂糖迁移率（Rf）分别为1.33、1.67、2.33的氧化LDL。研究巨噬细胞和内皮细胞对这几种不同氧化程度的LDL的结合和降解，发现当LDL修饰程度很低（Rf=1.33）时，OxLDL被巨噬细胞结合和降解的量接近、甚至低于天然LDL，而当修饰程度高时，被巨噬细胞和内皮细胞结合和降解的量随之升高，而且明显高于正常LDL（图9-8、图9-9、图9-10、图9-11）。

另有报道，正常细胞摄取OxLDL时，LDL受体与清道夫受体起协同作用。因为氧化程度不同。OxLDL的ApoB上可能残留多少不等的LDL受体识别位点。用单抗封闭这些位点时，细胞对OxLDL结合量和降解量下降。

三、OxLDL存在的可能性

（一）动脉粥样硬化损伤灶存在OxLDL

有学者发现人、兔动脉粥样硬化斑块处分离出的LDL的特性与OxLDL相似，包括电泳速度加快、ApoB降解等。而正常动脉壁处LDL无此特性。

最近，生产出的针对MDA-ApoB的单克隆抗体和MDA-VLDL、MDA-HDL、MDA-白蛋白不发生交叉反应。利用特异性抗原抗体反应推测来源于冠心病人的组织标本，发现在平滑肌细胞、巨噬细胞来源的泡沫细胞中和斑块核心脂质中都有免疫反应发生，而且在人、兔的动脉粥样硬化病灶区存在抗OxLDL的自身抗体。

（二）血浆中是否存在OxLDL

抗MDA-LDL自身抗体的滴度可用来预测冠状动脉粥样硬化进展。然而这些抗体和蛋白质（如蛋白）中MDA-赖氨酸加合物发生交叉反应。目前，尚没有血浆中存在OxLDL的直接证据，血浆中存在脂质过氧化物和TBARS，它们的含量可以用脂质TBARS荧光微量测定法测量。它们可能是氧化LDL的裂解片段。

有学者制备抗OxLDL的单抗，推测血浆中OxLDL的含量，并通过临床试验证实冠心病患者血浆中OxLDL浓度高于正常人。然而，由于血浆中是否存在OxLDL有待证实，故这种检测方法是否能够用于动脉粥样硬化的辅助诊断有待证实。

四、OxLDL与动脉粥样硬化

OxLDL可以通过以下途径促进动脉粥样硬化的发生、发展。

（一）参与泡沫细胞的形成

在早期的动脉粥样硬化损伤中，发现负荷脂质的泡沫细胞在动脉内膜下集聚。这些泡沫细胞主要来源于摄取OxLDL的单核/巨噬细胞。内皮下泡沫细胞的堆积在动脉粥硬化起因中有关键作用。

MarileeLoughecd等认为氧化LDL能抵抗组蛋白酶，从而抵抗溶酶体对OxLDL的降解，在细胞内堆积。当然，细胞内胆固醇量对清道夫受体的非下降调节是细胞泡沫化的主导原因。这些泡沫细胞以大量的二级溶酶体和胞浆脂滴为特点。脂质在泡沫细胞中沉积的结果使得动脉壁从最初的脂肪纹发展到更复杂的纤维斑块和粥样斑块。这些斑块最外层富含巨噬细胞来源的泡沫细胞，易于发生斑块破裂，引起血栓形成。

（二）促进细胞粘附和巨噬细胞源性泡沫细胞的产生

1.促进单核细胞的粘附和泡沫细胞的产生

单核细胞对动脉内皮粘附的增多是实验动物动脉粥样硬化早期表现之一。氧化LDL可以通过剌激细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达，使单核细胞，中性白细胞和淋巴细胞与内皮结合的数量增多，而且这种结合表现出高亲和力。还可以剌激内皮白细胞粘附分子-1（VCAM-Ⅰ）的表达，导致单核细胞的粘附移行。而且，OxLDL还能促使内皮细胞和血小板产生一种分子量为140kD_a的颗粒膜蛋白（GMP140）。这种颗粒膜蛋白能在细胞激活的基础上快速翻译到细胞膜上，结合中性白细胞和单核细胞。微氧化的LDL，不能被清道夫受体识别，但它已能剌激特定的单核细胞粘附分子的表达。

单核细胞粘附于内皮后移行入内膜。内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞分泌特定趋化剂，如单核细胞趋化剂1（MCP-1），MCP-1的合成受OxLDL的剌激。

图9-8 单核细胞源泡沫细胞的产生

ECAM-1，内皮白细胞粘附分子-1　1CAM-1，细胞间粘附分子-1

VCAM-1，血管细胞粘附分子-1MCP-1，单核细胞趋化蛋白-1

M-CSF，单核细胞集落剌激因子　GM-CSF，粒细胞-单核细胞集落剌激因子

氧化LDL剌激内皮细胞分泌粘附分子（ECAM-1、ICAM-1、VCAM-1），内膜单核细胞的增生受特定集落刺激因子（GM-CSF、M-CSF）的诱导。继而单核细胞分化为巨噬细胞并分泌特异的针对单核细胞的趋化剂（MCP-1）。进而，巨噬细胞通过清道夫受体聚积OxLDL，转变为泡沫细胞。

OxLDL激活内皮细胞，促使趋化因子、粘附分子、粒细胞一单核细胞集落剌激因子（GMCSF）和单核细胞集落剌激因子（M-CSF）分泌。所有这一切都会剌激巨噬细胞的增生和分化。M-CSF诱导巨噬细胞表面清道夫受体的表达，使OxLDL摄取增多，巨噬细胞泡沫化（图9-8）。

2．促进中性白细胞粘附

研究发现注射OxLDL，可在体外诱导内皮结合白细胞，Lehr等人进一步证实这一作用涉及血小板活性因子受体和CD_11b/CD₁₈粘附受体复合物。

（三）诱导平滑肌细胞增生、移行，产生平滑肌细胞源性泡沫细胞

OxLDL通过诱导巨噬细胞和平滑肌细胞产生血小板源生长因子（PDGF），促进平滑肌细胞移行。通过诱导内皮细胞产生碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），促进平滑肌细胞增生。最终，OxLDL诱导平滑肌细胞表面清道夫受体的表达，导致平滑肌细胞内吞OxLDL，继而产生平滑肌源性泡沫细胞（图9-9）。

图9-9 平滑肌细胞源泡沫细胞的产生

bFGF，碱性成纤维细胞生长因子

PDGF，血小板源生长因子

OxLDL引起平滑肌细胞从中膜移行入内膜，结果内膜增厚。激活平滑肌细胞和巨噬细胞分泌PDGF和bFGF，它们可诱导平滑肌细胞增生和移行。而且bFGF诱导清道夫受体表达。通过这些受体，平滑肌细胞聚积OxLDL，转变成泡沫细胞。

（四）促进血小板粘附、聚集、血栓形成

OxLDL抑制内皮细胞衍生的舒张因子（EDRF）或NO的合成，损伤动脉壁正常的舒张功能。而且OxLDL中的溶血卵磷脂诱导合成内皮细胞衍生的收缩因子（EDCF），诱使血管收缩。

氧化LDL可以促使血小板聚集、增强花生四烯酸代谢及血栓素B₂（TXB₂）的产生，减少膜脂流动性。OxLDL抑制前列腺素I₂合成酶，使前列腺素I₂（PGI₂）合成减少，激活血小板环氧化酶，使血栓素A₂（TXA₂）产生增加，破坏了PGI₂/TXA₂平衡，促进血小板聚集，引起血管痉挛和血栓形成。

（五）损伤内皮细胞

内皮细胞的损伤和功能改变是动脉粥样硬化发生的基础。内皮细胞的损伤在动脉粥样硬化的发病机理中作为起始机制，被认为具有重要作用。多种研究提示内皮细胞对自由基和脂质过氧化作用非常敏感。

LDL氧化过程中产生的脂氢过氧化物可以直接损伤内皮细胞。OxLDL可使内皮细胞对LDL的通透性增高，胞浆发生空泡变性，浆膜皱缩，甚至可使细胞最终坏死。内皮细胞受损又使内皮细胞保护剂PGI₂的合成进一步减少，促进中性粒细胞对内皮的粘着及呼吸爆发，促进血小板在内皮聚集、释放O₂^-，进一步加重内皮损伤。

OxLDL对细胞的毒性无需受体介导。细胞对OxLDL的易感性取决于细胞分裂所处的细胞周期和细胞内谷胱甘肽的含量。丙丁酚可转移并渗入细胞膜作为一种捕捉自由基的抗氧化剂对抗氧化压力。细胞和OxLDL孵育会使基质中TBARS增多。这以上二点似乎提示内皮细胞膜自由基反应特别是脂质过氧化，与OxLDL激发的内皮细胞损伤有关。内皮细胞膜脂质过氧化降低膜脂质流动性，增加膜对离子渗透性，抑制膜结合酶活性。OxLDL怎样诱导细胞膜脂质过氧化，还不清楚。

（六）产生抗OxLDL的自身抗体

在兔和人的血清中都发现了抗OxLDL的自身抗体，且抗体的滴度和心血管动脉粥样硬化进程密切相关，表明免疫机制在动脉粥样硬化发病机理中起了作用。

最近还发现粥样斑块区的炎性浸润物包含T淋巴细胞和B淋巴细胞。这些T淋巴细胞主要是由局部抗原激活的淋巴细胞。斑块区沉积的胆固醇还能通过诱导人类主要组织相容性Ⅱ类抗原表达，加强巨噬细胞呈递抗原的功能。

OxLDL通过以上多种途径在动脉粥样硬化的起始和进展中发挥了举足轻重的作用。

既然OxLDL和动脉粥样硬化的关系如此密切，那么抗LDL的氧化修饰就成为阻断动脉粥样硬化进程的关键环节。有可靠的证据表明LDL的氧化修饰，只有在LDL内源性、亲脂性抗氧化剂消耗殆尽后才会发生，其中维生素E作为第一线抗氧化剂，β-胡罗卜素作为抗LDL氧化的最后一层屏障。如果的确是这样，就可以解释摄食的抗氧化剂的血浆水平为什么和心血管疾病的危险性呈负相关。流行病学研究也进一步表明血浆中维生素E水平高的人群，心血管疾病患病的危险性低。这些研究给动脉粥样硬化的预防和治疗提供了新的思路。

第五节　一氧化氮

Humphrey于1935年在研究“笑气”（N₂O）时发现一氧化氮(nitricoxide,NO)以来，NO一直被看作是对生物有毒的简单无机分子。NO在常温下为气体，水中溶解度很小，仅1mmol/L，极易透过细胞膜扩散，NO拥有额外电子，具有高度的化学反应能力，在生物组织中半寿期仅有几秒种。近年来研究表明，NO作为可能的突触前递质和突触后逆信使在神经系统信息传递和发音中起作用；NO作为生物信使分子也在机体免疫和血液血压调节中起着重要作用。

一、NO的自由性质

在NO分子中，N原子外层有五个电子，O原子外层有六个电子，形成共价键后，在分子轨道上含有不成对电子（：N：：O：），因此它是自由基，不稳定，半寿期短，易生成过氧亚硝基阴离子ONOO^-，质子化后很快分解生成HO和NO₂自由基，在生物体内还可生成一系列的具有生物功能的自由基和硝基化合物。

二、NO的生成

NO在体内经一氧化氮合酶（nitricoxide synthase,NOS）的作用才能生成。NOS以L-精氨酸（L-Arg）和分子氧为底物，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）为辅因子提供电子，由黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和四喋呤传递电子，生成中间体对羟基-精氨酸，然后形成NO和L-胍氨酸（L-Citr），其中NOS是NO生成的最主要的限速因子。

三、一氧化氮合酶

NOS由1025个氨基酸残基组成，分子量为13.3kD。NOS广泛分布于机体内。按其存在的细胞类型不同，NOS可以为三种类型，即神经型NOS（nNOS）、内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。nNOS存在于视网膜、植物神经纤维、大脑皮层、海马、垂体后叶、丘脑、嗅球区粒细胞层、骨骼肌细胞和平滑肌细胞。iNOS存在于肝细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞。eNOS存在于血管内皮、支气管内皮和海马锥体细胞层。按同工酶分类，NOS可分为同工酶Ⅰ（NOSⅠ），又称为神经型（nNOS），主要分布在神经元的上皮细胞中。同工酶Ⅱ（NOSⅡ），又称为诱导型（iNOS），主要分布在细胞因子诱导的巨噬细胞中；同工酶Ⅲ（NOSⅢ）又称为内皮型（eNOS），主要分布在内皮细胞中。

利用特异的DNA探针已经证明NOSⅠ、Ⅱ、Ⅲ基因分别定位于12号（12q24.2～24.3）、17号（17p11～17q11）、7号（7q35～36）染色体。

根据克隆及cDNA结果推测，NOSⅠ的mRNA长度＞10kb，而其编码基因＞100kb，其基因详细结构不清楚。人NOSⅡ基因全长37kb，由26个外显子组成，人NOSⅢ基因全长21kb，由26个外显子组成。

第六节　自由基与细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）是细胞的主动死亡，它参与机体许多生理和病理过程，并起着调节作用。

一、细胞凋亡

细胞凋亡是Kerr等于1972年首先提出的一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，它具有特征性形态和生化改变，是细胞自身主动死亡的过程，又称为程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD），生命体内细胞死亡有两种完全不同的形式，当细胞遭受急性和严重损害时，细胞肿胀破裂，胞液外溢导致周围组织发生炎症，即坏死过程。细胞在正常死亡时，出现细胞收缩，细胞核成片状，电镜可见到细胞膜上有很多的小泡生成。DNA电泳区带呈梯状，这种方式称为细胞凋亡。细胞凋亡是指细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，参与胚胎发育及变形胸腺细胞的克隆选择、细胞介导的细胞毒作用、衰老造血细胞的清除、肿瘤发生、人类免疫缺陷、病毒感染及化学治疗等。因此，对细胞凋亡的研究成为免疫学、细胞生物学、肿瘤学和分子生物学等领域的热门课题。

二、细胞凋亡与自由基作用的关系

众所周知，氧化还原反应是人体内最为广泛和重要的化学反应，自由基尤其是活性氧（reactive oxygen species, ROS）及其衍生物自由基是氧化反应中的重要成分。ROS与衰老密切相关，而衰老细胞的死亡实质上就是细胞凋亡。

目前，研究较多的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）是由巨噬细胞和单核细胞产生，激活TNF受体可使细胞内ROS明显增加。体外试验表明TNF能诱导细胞凋亡，细胞对TNF的敏感性还与SOD的降低有关，如缺乏SOD的T细胞对TNF、电离辐射和高温引起的细胞凋亡更敏感。

据报道，能引起细胞氧化的因素均能引起细胞凋亡。电离辐射和紫外线照射能通过直接攻击水分子而在水中产生·OH，并能诱导细胞凋亡，如图9-10所示。H₂O₂在体内Fe²⁺分子反应生成超氧阴离子O₂^-和H₂O₂，通过对巨噬细胞和单核细胞的研究，Albina等提出NO也是细胞凋亡的诱导剂。抗肿瘤药物如阿霉素和顺铂等虽然本身不是自由基，但是它们可以引起ROS的增加；而另一种药物如Bathionine Sulfoxamine等则能消耗细胞内GSH，两类抗肿瘤药物能使细胞对多种因素诱导的细胞凋亡更敏感。

图9-10 氧化诱导细胞凋亡的机制及其调节

（源自：陆怡等生物化学与生物物理进展.23（2））

现已报道，有25个癌基因与细胞凋亡有关。与自由基尤其是氧化关系最密切的是bcl-2基因，bcl-2基因是人类发现的第一个死亡抑制基因。已证实，bcl-2基因表达能抑制多种因素（电离辐射、高温、GSH合成抑制剂、生长因子缺乏）引起的细胞凋亡，其机制不清，Kane等报导，bcl-2的表达并不能增加细胞SOD活性，可能是通过阻断电子传递链中ROS的产生，或者起了ROS清除剂的作用而调节细胞的氧化还原状态，从而调节细胞凋亡。

三、细胞凋亡相关基因

细胞凋亡相关基因大致可分为两大类，即凋亡促进（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它们分别起着促进凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之间还存在一定的相互关联。

1．凋亡促进基因

凋亡促进基因有ced-3,4、p⁵³、ICE、Bax、bcl-Xs、TGFβ等。其中ced-3，4是在线虫索中发现的，而p⁵³、ICE等存在于哺乳动物中。p⁵³为肿瘤的抑制基因，分为两型，一型是使细胞周期停止在GI期，抑制细胞繁殖的野生型；另一型是具有突变能力的变异型。野生型p⁵³可诱导易感细胞发生凋亡。白介素1β转换酶（interlukin 1-β-converting enzyme, ICE）,与线虫细胞凋亡相关基因ced-3有较高的同源性，具有直接诱导细胞凋亡的作用。Bax和bcl-Xs均为bcl-2基因家族成员，两者可结合形成二聚体或异体二聚体，两者之间的比例决定了细胞的命运。若Bax占多数，则bcl-2被抑制，诱导细胞死亡；反之，则Bax受到抑制,细胞得以生存。

2．凋亡抑制基因

凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是当前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一种，在人体多种形态的肿瘤中过度表达，可抑制由多种剌激包括化疗和放疗引起的细胞凋亡。bcl-2常在淋巴细胞系统（胸腺、脾、淋巴结）和神经系统（右脑、中脑，小脑）中表达，抑制该部位的细胞凋亡。淋巴性白血病细胞中bcl-2也是过度表达的。Bcl-X₁也是bcl-2家族成员，是由bcl-X编码的两种不同bcl-XmRNA而产生。bcl-X₁有抑制神经细胞凋亡的作用。

四、细胞凋亡与脂质代谢紊乱的关系

Forrest等^[3]发现H₂O₂诱导的细胞凋亡中，让H₂O₂作用于细胞膜两h后，用膜保护剂Trolox（VitE类似物）能阻止细胞凋亡的发生。由于ROS很容易与膜的多聚不饱和脂肪酸（PUFA）和胆固醇反应，引起氧化链式反应，因此膜脂质过氧化以后才有DNA损伤、细胞损害。最近Isabelle等^[5]报道，氧化低密度脂蛋白（OxLDL）可诱导细胞凋亡。

自由基尤其是ROS具有很强的生物活性，很容易与生物大分子反应，直接损害或者通过一系列过氧化链式反应而引起广泛的生物结构的破坏。为了减少有氧代谢过程中自由基对细胞的损害，细胞内有一系列有效的抗氧化防御机制，包括清除ROS的SOD、过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GSHP_X）、硫氧还原蛋白（phioredoxin）等和阻断过氧化链式反应的生育酚、胡罗卜素和抗坏血酸等。通常细胞处于氧化与抗氧化平衡中而维持着正常的功能。一旦氧化与抗氧化作用失衡，细胞的功能将会受到影响，细胞凋亡可能就是这种失衡的结局之一。

（周翔　郑芳）

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第十章　脂类代谢紊乱

临床上对脂质代谢紊乱的认识与血浆脂质及脂蛋白、载脂蛋白的测定方法的发展密不可分。50年代只能测定血浆胆固醇的含量以确诊高胆固醇血症。到60年代初期血浆甘油三酯测定方法的应用，使研究者把高脂血症分为三种：高胆固醇血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症合并高甘油三酯血症。60年代纸上电泳技术得到改进，提高了对血浆脂蛋白的分辨力和检出率。可将血浆脂蛋白分为α-脂蛋白、前β-脂蛋白、β-脂蛋白及乳糜微粒四种，并通过密度梯度离心，明确了血浆脂质是以脂蛋白的形式存在，临床上逐渐用高脂蛋白血症代替高脂血症。1967年Fredrickson等用改进的纸上电泳分离血浆脂蛋白，将高脂血症分为五种类型，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。1970年WHO加以改进，将Ⅱ型分为Ⅱ_a和Ⅱ_b，共六型。这些标志着对脂类代谢与动脉粥样硬化关系的研究已从血浆脂质水平发展到血浆脂蛋白水平。

但是血浆高脂蛋白血症分型，经各国实验研究及临床工作者应用，发现其存在局限性，如高脂蛋白血症分型仅以表型分类。不能反应其病因，HDL含量改变也未包括在内。1973年Goldstein和Brown对细胞膜LDL受体的研究成果表明，对脂质代谢与动脉粥样硬化关系的研究从脂蛋白水平进入载脂蛋白的分子水平，并发现了多种载脂蛋白缺乏或缺陷的疾患。近年来，为了便于从分子水平研究脂质代谢紊乱，主张以载脂蛋白的改变作为异常脂蛋白血症分类的依据，以完善1970年WHO的分型法。故本章主要介绍脂蛋白和载脂蛋白，以兼顾习惯用法和发展趋势。

第一节　高脂血症

高脂血症（hyperlipidemia）是指血中脂类浓度升高。血浆中主要脂类有总胆固醇即游离胆固醇和胆固醇酯、甘油三酯。当其中一种或几种脂类升高均称为高脂血症。

高脂血症中90%以上是高脂蛋白血症。测定血浆胆固醇和甘油三酯浓度即可诊断高脂蛋白血症。最主要的例外是LDL增加伴随HDL降低，对这种个体所测定血浆胆固醇和甘油三酯水平均无法解释这一现象。

NIH认为成人血清胆固醇超过5.18mmol/L应开始治疗。而血甘油三酯超过4.52mmol/L 即可认为是高于正常，一旦超过11.29mmol/L，认为患急性胰腺炎的危险很大。当血胆固醇和/或甘油三酯超过极限，为了预防和降低冠心病发病率，应开始进行饮食疗法。此外并发其他危险因素。如遗传、高血压、吸烟和肥胖者，若血清总胆固醇浓度低于3.89mmol/L的个体则发生动脉粥样硬化的可能性很小。

第二节　高脂蛋白血症

高脂蛋白血症（hyperlipoproteinemia）指的是血清脂蛋白浓度升高。根据异常脂蛋白的表型，辅以其他方法对高脂蛋白血症进行分类。如将高脂蛋白血症分为原发性和继发性，继发性高脂蛋白血症是指由其他已知疾病引起的高脂蛋白血症；也分为遗传性的和非遗传性；还可根据脂蛋白组分含量的不同进行分类，如高VLDL胆固醇血症、高LDL胆固醇和高HDL胆固醇血症。

表10-1 继发性高脂蛋白血症的病因

高脂蛋白血症的类型很多，但主要是遗传性高脂血症，共有六种常见异常脂蛋白类型，可用表10-1来概括。主要用四种脂蛋白系列中的三种即乳糜微粒、VLDL和LDL（包括IDL）作为依据来划分。Fredrickson表型分类系统没有考虑HDL和其他脂蛋白的重要性。最近世界范围的流行病学调查发现HDL胆固醇浓度与冠心病风险存在有统计上的负相关系。因此，测定LDL胆固醇和HDL胆固醇可从侧面反映血中脂蛋白的水平。

临床上，高脂蛋白血症的分类主要依靠血浆脂类及异常脂蛋白的电泳图谱，进行综合分类，如表10-2所示。每型的琼脂糖脂蛋白电泳分类图见图10-1。

图10-1 高脂血症的脂蛋白琼脂糖电泳图

表10-2 人高脂血症分型及其特征

一、高乳糜微粒血症

高乳糜微粒血症（hyperchylomicronemia）患者新鲜血清外观呈乳白色混浊，4℃冷藏过夜血清外观：上层因有乳糜微粒漂浮而呈现糜状，下层清亮透明状。本症为常染色体隐性遗传，家族遗传性纯合子型患者除血脂改变外，临床症状也明显。而杂合子患者，虽呈现高甘油三酯血症，但症状不显着。

因乳糜微粒含量增加的缘故，该型脂蛋白异常以高血甘油三酯浓度为特征，一般高于11.29mmol/L。因乳糜微粒也含胆固醇，其胆固醇随甘油三酯升高亦增加，LDL和HDL通常偏低，而VLDL可轻度增加。

由于肝外组织脂蛋白脂肪酶活性缺陷，从肠粘膜细胞输入血液中的乳糜微粒不能经脂肪组织进行正常的分解代谢，使血中乳糜微粒贮留。近年来从载脂蛋白的角度研究证实，此类患者ApoCⅡ含量不足，不能激活脂蛋白脂肪酶，为其主要病因。CM中TG不能水解转变成CM残粒，无法被LDL受体识别摄取进行代谢，从而造成CM在血液中堆积。

原发性高乳糜微粒血症常在儿童期发病。虽然这种脂蛋白异常常为原发性和家族性，但也可由几种其他疾病或代谢状态而引起。因此，应排除继发性脂蛋白异常的可能性（见表10-1）。

排除继发性原因后，原发性可根据如下表现进行证实：①脸黄疣、肝脾肿大、视网膜脂血、腹痛和早发胰腺炎；②服药可引起继发性高甘油三酯血症；③血浆甘油三酯脂酶活性降低；④无脂肪饮食甘油三酯降低和乳糜微粒消失；⑤家系分析证实为常染色体隐性遗传。

当今降脂药对降低血清甘油三酯无效，因此治疗这种异常症只能采用低脂肪饮食，因乳糜微粒随进食脂肪的消化而产生，治疗方法是将饮食脂肪降到占总能量消耗的10%，可在24h内降低血清甘油三酯，一般是先将血清甘油三酯降到11.29mmol/L以下，从而降低急性胰腺炎的发病风险。第二步再降至正常。一般推荐健康人甘油三酯水平＜2.26mmol/L，如表10-3所示。

表10-3　NECP推荐甘油三酯风险分级

二、高β脂蛋白血症

高β脂蛋白血症（hyperbetalipoproteinemia）的特点为血浆胆固醇浓度升高而甘油三酯大多正常，血清外观清晰属于Ⅱ_a型，又称为家族性高胆固醇血症，血清脂蛋白电泳呈现浓染的β-脂蛋白带，提示脂蛋白升高，故又称为高β脂蛋白血症。引起原发性高胆固醇血症的原因有：①VLDL产生过多；②VLDL转换成LDL速率增加；③LDL含胆固醇酯过多；④LDL结构缺陷；⑤每个细胞上LDL受体数量减少或活性降低。据估计约50%的胆固醇浓度改变是由遗传决定的，脂蛋白电泳图谱显示β-脂蛋白升高而前β-脂蛋白正常，该病有如下特征：①培养的成纤维细胞上有功能的LDL受体数量减少，此项具有确诊价值，具体有LDL受体缺乏、LDL受体缺陷和入胞缺陷三种表现；②婴儿呈现Ⅱ型表现；③严重者有黄色瘤；④30～40岁者，常见有早发冠心病。

胸腺机能减退、急性卟啉综合症、异常γ球蛋白血症、阻塞性肝病、高饱和脂肪和胆固醇饮食引起的继发性高β脂蛋白血症与原发性高β脂蛋白血症区分开来。原发性高β脂蛋白血症可用下面几条确证：①家系分析，包括儿童；②连续8周进低胆固醇（＜300mg/日），高多不饱和脂肪酸饮食（多不饱和/饱和脂肪酸为1：1.2）后仍有顽固性高胆固醇血症；③腱黄瘤、黄色瘤和角膜弓的出现；④LDL受体缺乏或缺陷。

家族性高胆固醇血症（12.95～38.85mmol/L）需要特殊治疗。除了下面要提到的饮食疗法和药物疗法外，很多家族性高胆固醇血症病人要求每3～4周滤出血浆中的LDL。特别严重则应进行肝移植。对非家族性高胆固醇血症，第一步治疗是严格降低饮食脂肪。如没有效果，可用降脂药。

食物疗法的目的在于保持充足营养前提下降低血LDL胆固醇。NECP成人治疗小组推荐食物疗法分两步，病人体重过重时应降低总脂肪和饱和脂肪酸及胆固醇的摄入，降低体重，这一步是通过降血压、升HDL胆固醇、降低糖尿病发病率来降低冠心病发病率，第一步食物疗法开始4～6周后检测LDL胆固醇和HDL-胆固醇水平，3个月后继续监测。如降胆固醇目的未达到，病人应接受第二步疗法。

如食物疗法没有效果，应用药物治疗，降胆固醇药物包括胆酸多价螯合剂（消胆胺或Cholestipol）；HMG-CoA还原酶抑制剂，如Lovastatin(Mevacor)、Prarastatin(Pravacol)、Simvastatin(Zocor)、Fluvastatin(Lescol)、烟酸和Probucol。药物降脂效果应在4～6周和3月进行监测。

三、复合性高脂蛋白血症

家族性复合性高脂蛋白血症（combinedhyperlipoproteinemia）的特点有：①培养的患者成纤维细胞LDL受体数目正常；②儿童缺乏高β脂蛋白带；③很早即出现高甘油三酯血症；④患者家系连续几代出现多种脂蛋白异常图谱；⑤通常为高β脂蛋白且伴有高胆固醇血症，如图10-2所示。

复合性高脂蛋白血症最常见的原发性高脂蛋白血症之一。在一个家系内脂蛋白表型散在分布，病人的LDL和VLDL同时升高。同一个家族中，高β脂蛋白血症和前β脂蛋白血症可分别存在于不同病人中。复合性家族性高脂蛋白血症一般要到成年时才能发现。临床上，这种病人冠心病发病率增加，常伴糖尿病，有高尿酸血倾向，而肌腱炎和结节黄色瘤发病率相对较低。家族性复合高脂血症的遗传方式还未确定。

图10-2 家族性复合型高脂血症与高载脂蛋白

β-脂蛋白血症的脂蛋白代谢

ApoB异化正常，因VLDL的ApoB合成亢进，促使

LDL的ApoB再次合成增加

这种脂蛋白异常的特点是：总胆固醇、LDL、甘油三酯、VLDL等升高，有漂浮β脂蛋白出现。血浆电泳图谱中，除β-脂蛋白增高外，前β脂蛋白含量升高，但二者并不融合，又称为Ⅱ_b型高脂血症。Ⅱ_b型与Ⅱ_a型的主要区别是LDL受体活性正常，患者多合并肥胖，糖代谢及胰岛素分泌异常。Ⅱ_b型为显性遗传性疾患。本病VLDL合成量过多，ApoB₁₀₀合成量比正常高两倍，LDL也增高，另外VLDL合成增加的同时，VLDL代谢分解速度并未增强，从而使过量合成的VLDL不能加速分解，造成血浆中VLDL蓄积，同时LDL代谢速度也减慢。在确诊本型原发性脂蛋白异常时必须排除继发性高胆固醇和高甘油三酯的病因，应进行家系分析，应了解影响甘油三酯的因素。人群调查研究表明，随着年龄增加，甘油三酯水平也增加，四分之一的中年男性的甘油三酯超过规定的极限值，这说明甘油三酯极限值虽有统计意义，但不能代表其生理极限。

在评估该型脂蛋白异常时，应考虑食物中碳水化合物的作用。据报道，高甘油三酯血症患者禁食后可因进食碳水化合物而产生本型的电泳图谱。因此，确诊复合性高脂蛋白血症不能象β脂蛋白血症或高前β脂蛋白血症一样仅用脂蛋白电泳即可确诊。下面要提到的宽β脂蛋白血症不再被认为是独特的和纯合子的家族性高胆固醇血症，而是由高浓度的Lp（α）或称“沉淀性”前β脂蛋白引起的，电泳图谱易与复合性高脂血症相混淆。

对复合性高脂蛋白血症的治疗应集中在降LDL-胆固醇和甘油三酯浓度。降LDL-胆固醇的方案在高β-脂蛋白血症中已详述。降甘油三酯和VLDL胆固醇稍有区别，先进行食物疗法，关键是碳水化合物和能量，要求限制乙醇、加强体育锻炼、控制体重。当病人有很高甘油三酯时需用药物治疗。降甘油三酯药物有安妥明和Gemfibrizol，它们同时可使VLDL和LDL胆固醇也随之降低。治疗复合性高脂血症的药物常选烟酸，它能有效降胆固醇（LDL胆固醇）和甘油三酯，同时升高HDL胆固醇。

四、异常β脂蛋白血症

异常β脂蛋白血症（dysbetalipoproteinemia），也称阔或宽β脂蛋白血症。主要特征是血浆胆固醇和甘油三酯升高、异常LDL（更确切地说是IDL处于密度＜1.006g/ml组分中）。这种异常LDL常与前β带融合产生“阔β带”，因而出现β-移动度的VLDL，故又称为高β-VLDL血症。用超速离心法测量密度小于1.006g/ml组分的脂固醇和甘油三酯有助于异常β脂蛋白血症的确诊。

测定密度小于1.006g/ml组分的脂蛋白组成比单纯用电泳测定漂浮β脂蛋白来诊断异常β脂蛋白血症更可靠。临床上，当甘油三脂浓度在1.68mmol/L以上时，用血浆VLDL-胆固醇/甘油三酯来区分这种高脂蛋白血症，若甘油三酯超过11.29mmol/L时易出现错误的诊断。有主张以VLDL-胆固醇/甘油三酯≥0.3诊断为异常β脂蛋白血症；比值在0.25～0.29时为可疑，再用等电聚焦检测ApoE的E₂～E₃进行证实。该型又称为Ⅲ型高脂血症，属显性遗传。多见于ApoE₂/E₂型，LDL受体的结合能力仅是ApoE₂/E₃型的20%～40%。其代谢改变是：①β-VLDL经肝脏的ApoE受体清除受阻；②肝脏从CM残粒获得的外源性胆固醇减少，自身合成Ch并分泌VLDL增多，使VLDL过度生成而堆积于血浆；③LPL活性降低，VLDL在体外不能转变成LDL，Ⅲ型患者除β-VLDL出现外，Ch和TG均升高如图10-2所示，Ⅲ型比较罕见。

临床上，本病因年龄、性别和肥胖程度不同而表现不一。还与胸腺机能减退和酒精中毒有关。阔β脂蛋白血症引起的黄色瘤称为斑状黄瘤（xanthoma striatum palmare），这种桔黄色或黄色掌斑状黄色瘤是最轻微的损害，很容易发现。如进一步发展可产生旋涡状突起甚至掌纹消失和数字式皱折。轻者损伤存在于局部掌面，严重者产生结节，更甚者使手掌残废。

阔β脂蛋白血症与冠心病正相关，可用饮食疗法和药物疗法治疗。这种脂蛋白异常与心血管病的联系明显不同于其他家族性高β脂蛋白血症与心血管病的联系，本型对外周血管损害与心血管病的损害或冠心病一样多见。继发性阔β脂蛋白血症常由胸腺机能不全、痛风、糖尿病和急性肾功衰接受血液透析引起。

五、高前β脂蛋白血症

阔β脂蛋白血症（hyperprebetalipoproteinemia）也称内源性高脂血症或碳水化合物诱导的高脂血症，很多学者不再接受后一种说法，因碳水化合物诱导的高甘油三酯血症也可在正常脂代谢个体中出现。

根据甘油三酯浓度增加，总胆固醇正常或中度升高、血浆4℃静置10～12h没有乳糜微粒可对高前β脂蛋白症作出初步诊断属于Ⅳ型高脂蛋白血症或者称为高VLDL血症。电泳后有明显的前β脂蛋白带、浓染、增宽，而LDL胆固醇仍在正常范围，还可用生化指标用来证实高前β脂蛋白血症。确定高前β脂蛋白血症后，应进一步区分是原发性还是继发性的。

原发性高前β脂蛋白血症的诊断标准如下：①高前β脂蛋白的电泳图谱；②VLDL胆固醇升高；③一个或更多一级亲属有这种异常；④近亲没有其他原发性脂蛋白异常。

治疗方案在复合性高脂血症中已详述。

六、混合性高脂蛋白血症

电泳图谱呈现乳糜微粒及前β-脂蛋白染色带的浓染。属于高乳糜微粒和高前β脂蛋白二者都存在的混合型高脂蛋白血症（mixedHyperlipoproteinemia），即Ⅴ型高脂血症。将患者血清置4℃冷藏10h后发现血清上层有漂浮的奶油盖状乳糜微粒层形成奶油盖，下层呈混浊状，属于罕见的血清外观。甘油三酯水平与高CM血症相似。血LDL-C和HDL-C低于正常，Ch在正常范围，VLDL-C超出正常范围，VLDL-C/VLDL-TG低于0.3。若给予患者注射肝素后，血清CM消失。与Ⅲ型不同点是Ⅴ型人血清VLDL-C/VLDL-TG在0.3以上。该型患者，若仅是LPL活性降低，属显性遗传；若既有LPL活性降低又有ApoCⅡ减少，则属于隐性遗传，常于20岁前发病，家族史明显的Ⅴ型者，丘疹状黄色瘤的发病率可高达30%～50%，并伴有急性胰腺炎和肝脾肿大。因ApoCⅡ缺乏，LPL活性降低，VLDL生成过多而代谢速率降低等原因导致VLDL在血浆中堆积。

这一类型脂蛋白异常，常见腹部症状，有胰腺炎、疹样黄色瘤、脂质肾炎、肝脾肿大。与高乳糜微粒血症相反，本型好发生于成年人，一般50～60岁发病，女性发病迟于男性。

`此型也可由很多不同疾病、药物、饮食习惯等原因引起，故应仔细区分原发性和继发性。分析饮酒史，服用雌激素或固醇药物，进行尿液分析，检测禁食或餐后2h血糖和肝、甲状腺、肾功能均有助于区分原发性和继发性的诊断。

混合型高脂蛋白血症的生化缺陷仍不是很清楚。患者体内VLDL合成过剩，分解代谢迟缓，同时乳糜微粒分解代谢也缓慢，致使该型出现高CM血症与高VLDL血症混合存在。

唯一治疗高乳糜微粒的方法是低脂肪饮食。用限制饮食来减轻体重以治疗混合型高脂蛋白血症可取得很好疗效。也可用如下药物进行治疗：烟酸、novethindroml、oxandrolone、benzafibrate、gemfibrizol或clofibrate。

七、高HDL血症

有报道，血浆HDL含量过高导致高HDL血症，也属于病理状态，HDL具有抗动脉粥样硬化作用，是人们公认的，然而并非血浆HDL含量越高越好，血浆HDL-胆固醇（HDL-C）含量超过2.59mmol/dl定义为高HDL血症，现已查明，高HDL血症是因为有CETP和HTGL等活性异常所致，高HDL血症又分为原发性和继发性，原发性高HDL血症的病因有以下几种①CETP缺损；②HTGL活性降低；③以及其他不明原因。继发性高HDL血症病因有：运动失调；饮酒过量；④原发性胆汁性肝硬化；⑤治疗高脂血症的药物引起；⑥其他原因。总之，CETP及HTGL活性降低是引起高HDL血症主要的原因。CETP缺陷，HDL上的CE蓄积，使HDL增多；若HTGL活性降低，HTGL与HDL被肝细胞摄取并使HDL₂→HDL₃转换过程有关。HTGL活性降低使HDL被肝细胞摄取量减少而停留在血液中并使其浓度增加，出现高HDL血症。血清中总胆固醇轻度或中度升高，HDL-C高达正常人3～5倍的高值，血清ApoAⅠ、CⅢ，E明显增加，ApoB呈低值。CE量增加，因为CETP活性低，从HDL转运到含ApoB的脂蛋白的CE量减少，即运输障碍所致。高HDL血症多见于CETP缺乏者，易出现多分散LDL，而HDL颗粒变大，有实验表明，CETP活性低的动物作胆固醇负荷实验很容易形成动脉粥样硬化，对人而言，高HDL血症与动脉粥样硬化的关系有待进一步研究。

HDL按超速离心法可分为HDL₂和HDL₃，Blanche及Albers等报道，用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳可将HDL分为HDL_{1，2a，2b，3a，3b，3c}六种亚组份颗粒，如图10-4所示。健康人HDL3c Stokes直径7.8nm；HDL3b为8.4mn；HDL3a为9.0mn,HDL2a为9.6nm和HDL2b为10.8nm。并报道冠心病患者大型颗粒HDL_2b减少,小颗粒HDL_3b增加，认为HDL_2b的上升有抗动脉粥样硬化的作用，HDL_3b颗粒的增加与动脉粥样硬化形成有关，进而推测高HDL_3b血症中若是HDL_3b组份增加者,则可以引起脂质代谢障碍。

图10-3 富含TG脂蛋白的代谢与Ⅲ型高脂血症发病机制

近期有作者提出HDL-C与长寿的问题。Jeffery等于1996年报告的一例59岁的妇女，血胆固醇为9.1mmol/L,HDL-C为5.7mmol/L、LDL-C为2.8mmol/L，TC与HDL-C的比值为1.6（心血管病危险因素比值为5.0），ApoAⅠ含量超过正常对照者。该患者经其他有关的物理检查，未发现有任何动脉粥样硬化的征兆。将患者血浆ApoAⅠ提纯作体内的代谢研究提示，患者血浆ApoAⅠ的清除率是正常的，并诊断为高α-脂蛋白（HDL）血症。经家族史调查，该妇女父母亲及外祖父均为长寿者，尚未发现与脂代谢有关的疾患。

该例提示了长寿的遗传倾向问题。导致动脉粥样硬化形式的因素是多方面的，环境因素与遗传因素对其病理生理的过程具有重要影响。众所周知，环境因素与吸烟、饱和脂肪酸和食物胆固醇消耗以及营养过剩，均与症状性心血管病的发生有关。同样，基因变异所致的LDL-C极度增高HDL-C总量低下均可加速动脉粥样硬化的形成。1988年leaf报道百岁老人的共同特点是每日体力劳动和低饱和脂肪饮食。Schaefer等于1989年报导，80岁以上的长者均无血浆HDL-C含减少，并认为HDL-C与长寿有关。Gofman报导，提高HDL-C基因可以防止动脉粥样硬化的发生，为此提出，通过基因能否预防动脉粥样硬化的问题。流行病学研究表明HDL-C浓度愈高，发生心血管病的危险性愈低。根据Framingham的1988年的报道，HDL-C含量为1.5mmol/L或更高者，即使同时有HDL-C的增高，对心血管病的发生LDL-C仍属于阴性危险因素。此外，降低LDL-C浓度的干预试验提示，HDL-C可以提供相对的保护作用，LDL-C浓度降1%，可使心血管危险性降低2%；然而HDL-C浓度增加1%，则使心血管病发病率至少降低2%～3%。该研究表明，HDL-C对心血管疾病确实有预防作用。

临床已注意到HDL-C的预防作用。HDL的生理功能是通过HDL中各组份介导的。HDL的主要载脂蛋白是ApoAⅠ、AⅡ，ApoAⅠ在肝和肠内合成，ApoAⅡ仅在肝内合成。HDL中各不同密度的颗粒，其载脂蛋白组成是有差异的。含有AⅠ颗粒而不含AⅡ颗粒，称为脂蛋白AⅠ唯一颗粒，代号为LpAⅠ-Only particles,该颗粒可以防止心血管疾病。其他各种蛋白质，也可影响HDL颗粒的成份和代谢，LCAT和HL是HDL中脂质代谢调节中心，CTP在该颗粒核心内，以TG从易致粥样硬化的含有ApoB的脂蛋白中交换胆固醇酯。血小板活化因子酰转移酶能使HDL和LDL中的磷脂生成具有生物活性的溶血磷脂酰胆碱及小板活化因子（PAF）。还有系列活性代谢酶，可以保护HDL的脂质受氧化性损伤，从而增强HDL对心脏的保护功能。

目前所知，HDL-C浓度升高有三种遗传原因。其一是遗传性ApoAⅠ基因过度表达；其二是家族性高α脂蛋白血症，这两种遗传因素导致HDL-C浓度升高，ApoAⅠ含量增加，使心血管发病率降低；其三是CTP基因突变，使胆固醇酯在血浆脂蛋白中与甘油三酯交换能力降低，进而导致HDL-C浓度增高。有报导，CTP缺乏的纯合子个体，HDL-C浓度可超过3.9mmol/L，与此相反，在ApoAⅠ产生过多的患者，HDL浓度过高则是HDL从血液循环中清除过缓所致。然而HDL浓度增高可防止早发性心血管病，还有待证实。

HDL可以通过不同的机理发挥作用。它能影响血管舒缩力或诱导内皮细胞增殖，有助于动脉壁对抗内皮下组织直接暴露于血循环所致的损伤；HDL又能缓冲LDL的氧化；HDL能清除自由基保护LDL免遭氧化的损害。HDL可清除细胞内过多的胆固醇，以减少粥样硬化斑的形成。其中的ApoAⅠ基因过表达可使HDL-C浓度增加并减弱粥样化的发展。ApoAⅠ基因可能是一种杂交基因（Methuselah genes），该基因可以改变动脉粥样硬化的慢性病的多种遗传因子的性状。ApoAⅠ基因过度表达能降低心血管疾病发病率的事实，指示可以通过基因传递技术的使用，使人们可以采用各种杂交基因治疗甚至预防心脑血管性疾病。

Fredrickson于1963年将高脂蛋白血症分为六型，在临床诊治疾病过程中有一定的意义，然而从临床实验室诊断方法学考虑，作脂蛋白检测有一定难度，电泳分离法欠准确，按超速离心法，操作时间过长，难以快速定量。另外，高脂蛋白血症多数与遗传有关，目前可采用载脂蛋白基因分型。载脂蛋白的基因分型是目前研究脂质代谢及探讨动脉粥样硬化发病机制的热门话题。

图10-4 健康人HDL亚组份颗粒的聚丙烯酰胺梯度（4%～30%PAG）电泳图

（源自：Blanche,P.J.et al B.B.A,1981）

第三节　遗传性载脂蛋白代谢异常

一、ApoAⅠ异常症

Assmann分析近2万人发现500人中有1例结构基因杂合子出现，比野生型ApoAⅠ多一个或少一个正电荷或负电荷，大多数变异体无明显血脂的变化，仅有ApoAⅠMarburg病在107位上的Lys缺失，引起轻度的TG升高。ApoAⅠ的Milano变异体（173Arg→Cys）血浆中HDL有所降低，然而冠心病发病率未见增加，ApoAⅠ和ApoCⅢ基因重排导致的变异是可引起家族性ApoAⅠ和ApoCⅢ缺乏症，Karathansis首先用EcoRⅠ限制性内切酶分析ApoAⅠ基因，发现家族性早发冠心病患者都出现6.5kb片段纯合子，正常人为13kb纯合子，其杂合子为13kb/6.5kb，推测纯合子6.5kb与动脉粥样硬化发病有关。

ApoAⅠ与ApoCⅢ缺陷者表现为血HDL水平降低，易出现早期动脉粥样硬化。有报道ApoAⅠ减少，会导致LCAT活性降低，使ApoAⅠ、ApoAⅢ的脂蛋白如CM置换发生障碍，从而在体内蓄积。

单一氨基酸变异的ApoAⅠ变异体如表10-4所示。

表10-4 单氨基酸置换的ApoAⅠ变异体

二、ApoB异常症

ApoB缺陷，出现无β-脂蛋白血症或低β脂蛋白血症，无β-脂蛋白血症是纯合子隐性遗传病，称为Bassen-Kornzeig症候群，脂肪吸收障碍（脂肪泻），红细胞变形（棘状红细胞症）和运动失调等症状。

低β-脂蛋白血症为显性遗传病，杂合子者血中LDL浓度低，与无β-脂蛋白血症有区别，与纯合子的无β-脂蛋白血症出现类同的症状。其原因是ApoB结构基因异常，经三个家族分析，患者肠粘膜细胞的ApoB₄₈合成正常而不能合成ApoB₁₀₀，即ApoB₄₈外显子以外的ApoB₁₀₀外显子领域异常，由于LDL受体领域附近的点突变（Glu3500→Arg），使LDL受体结合能力降低。

ApoB₁₀₀的羧基端是其与LDL受体结合区，有下列依据证明这一推测：①Milne等用30种单克隆抗体观察能与LDL受体结合的肽链区域，即ApoB₁₀₀的2980～3780一段可被阻止，其他单克隆抗体无阻止作用；②缩短的ApoB异构体缺乏羧基端，则不能与LDL受体结合；③羧基端有三个区域可与肝素结合，该区域含有几簇带正电荷的氨基酸残基，其中之一的序列与ApoE区域的序列有同源性，这一区域称为ApoE区，已证实这一区域可与LDL受体结合，其序列为3359～3367氨基酸残基位置，带正荷的氨基酸簇相当保守；④经化学修饰的带正荷的ApoB₁₀₀不能与LDL受体结合；⑤若ApoB₁₀₀分子中3500Arg→Glu，LDL分子不能与LDL受体结合，导致高脂蛋白血症，如Innerarity的家族性高脂蛋白血症。

ApoB的cDNA中某一核苷酸的变异或缺失，均可引起家族性低β-脂蛋白血症，迄今已发现有25种之多，血浆LDL浓度降低，杂合子患者血浆中ApoB和LDL浓度为其正常的1/4～1/2一般无症状，纯合子则更为严重，包括脂肪吸收不良，棘型红细胞，视网膜色素沉着和神经性肌肉退变。

ApoB₁₀₀是血浆脂蛋白中分子量最大的一种载脂蛋白，氨基酸链最长，因此在合成蛋白质和形成脂蛋白的过程中，任何部位或环节均可能发生变异，可想而知，今后发现的ApoB₁₀₀的变异会更多。

三、ApoCⅡ异常症（遗传变异）

ApoCⅡ缺陷导致LPL活性降低。因为ApoCⅡ是LPL发挥催化作用不可缺少的辅因子。出现高TG血症，高CM血症，发病率约1/10万，ApoCⅡ多种型异常的报道，如表10-5所示。

表10-5 ApoCⅡ的突变

（源自Fojo ss et al.1990）

四、ApoE异常症

ApoE是LDL受体的配体，其表型不同，与LDL受体的能力也不同，E4和E3几乎相同，E2几乎无结合能力。E2纯合子因为第158氨基酸残基突变，因为CM残粒或β-VLDL的滞留而导致高Ch，TG血症高脂蛋白血症，易出现早期动脉硬化，典型例子是家族性Ⅲ型高脂血症，ε2基因纯合子人群分布频率为1%，家庭性Ⅲ型高脂血症发病率为一万人有2～3人，究其原因，ApoE₂纯合子遗传因素是主要的，然而还与环境因素等的影响如甲状腺机能亢进肿瘤以及家族性复合型高脂蛋白血症等。ApoE突变点的主要位点如表10-6所示。

表10-6 主要ApoE突变点

（源自Mahley R W,1991）

第四节　继发性高脂蛋白血症

某些原发疾病在发病过程中导致脂质代谢紊乱，进而出现高脂蛋白血症，称为继发性高脂蛋白血症，作为继发性高脂血症或高脂蛋白血症原因是多方面的，如糖尿病、肾病及某些内分泌紊乱等继发性高脂蛋白血症。

第五节　高脂血症的监控

监控高脂血症是矫正冠心病危险因素中的一个重要方面。减轻高脂血症和其他非脂质危险因素已多次被证实可以缓解冠心病的发展并推迟甚至扭转已形成的冠心病的发展。冠心病的危险因素可分为两类：一类是可校正的因素如吸烟、高血压和肥胖；另一类是不可更改的因素如年龄和性别。

冠心病的非脂质性危险因素有：①年龄，男性≥45龄；女性≥55龄或者雌激素尚未改变的绝经早期；②早发性冠心病家族史；③吸烟；④高血压；⑤糖尿病。

一、按高脂血症不同时期进行监控

由于控制高脂血症的早期和晚期的方法是不同的，两期的控制情况必须加以区别。晚期高脂血症主要有关因素是：糖尿病、酗酒、甲状腺机能减退和肾病综合征。

二、控制方案

控制的目标是降低血浆胆固醇和甘油三酯，尤其是对胆固醇的控制。图10-5为美国最新控制高脂血症的方案，供借鉴参考。此方案是一种逐步控制疗法，简单易行而又能为人们所接受的方案，其标准是按冠心病危险因素中脂质指标为依据。该控制方案在很大程度上依赖于生化指标，包括TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（α）、ApoAⅠ、ApoB₁₀₀必查项目，必要时加测ApoCⅡ、CⅢ、ApoE、ApoAⅡ、ApoAⅣ等。对此，实验室分析检测的脂质指标，应该是准确无误，并符合临床化学国际质量控制标准，保证其检测结果的准确和精密度。由于冠心病的发生率存在性别差异，有学者建议对女性患者的监控和治疗采用有别于男性的方案。

图10-5 高胆固醇血症的控制方案（1993年制订）

直到目前报道的高脂血症控制方案表明，首先是调整饮食，这可能既费时又费力，然而是不可忽视的重要一步。饮食控制作为一项独立的治疗方案，需要经过3～6个月才能判断其疗效。目前推荐的从减少血浆胆固醇和甘油三酯为目的的控制饮食的治疗方案为：①减少食物热量的摄取，保持标准体重；②增加富含纤维素食物的摄入；③减少脂肪的摄入，使其占总热量的30%左右；④减少饱和脂肪酸的摄入，使其占脂肪量约30%；⑤适当饮用低度酒。主要目的是提供低脂肪饮食，但是，对于不同的患者，还得作出相应的调整，以达到预防和治疗高脂血症的目的。

三、药物治疗

对高脂血症必要时以药物治疗作为监控管理的一种补充手段，目前常用胆汁酸分离树酯、HMGCoA还原酶抑制剂、纤维素盐和烟酸及其衍生物。治疗原生性高胆固醇血症常用的药物是胆汁酸分离树酯和HMGCoA还原酶。治疗原发性高甘油三酯血症和复合型高脂血症者常用纤维酸盐或烟酸的衍生物。

总之，建议减少食用红色肉类和奶制食品，多食疏菜、水果、豆类和鱼类（尤其是鱿鱼、鲑鱼、金枪鱼和鲭鱼）。除了调整饮食结构，减肥达到标准体重以外，身体锻炼是很重要的，再辅以药物治疗，可望减少高脂血症和动脉粥样硬化发病率。

（周新　钱士匀）

（脂类代谢紊乱）参考文献

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第十一章　动脉粥样硬化有关细胞及生物活性因子

随着血管细胞研究的深入，血管细胞的许多功能不断被揭示和认识。近年来，由于动脉粥样硬化诱发的心肌梗塞、脑梗塞等疾病的增加，引起人们对动脉硬化发生、发展机制给予更深切地关注。经许多实验证明，这一疾病发展过程与血管细胞功能异常密切相关。

第一节　血管内皮细胞的功能

在动脉粥样硬化形成过程中，首先表现为脂质沉积于血管壁，然后巨噬细胞吞噬这些脂质，逐渐泡沫化，继而平滑肌细胞增殖生长。平滑肌细胞形态、生理生化的变化是与动脉粥样硬化有关的又一重要因素。

一、血管平滑肌细胞的形态与性质

血管平滑肌细胞在增殖状态下，主要表现为细胞胞浆内蛋白质的变化。例如，胎儿期及培养细胞的增殖期平滑肌细胞含有广泛丰富的肌丝，表现为蛋白质合成和胞外基质分泌旺盛，这时称之为合成型细胞。反之，成人机体动脉中膜平滑肌细胞称为收缩型细胞。

随着细胞形态的改变，肌丝不仅在量上发生变化，组成肌丝结构的蛋白质种类也发生变化，已知平滑肌肌动蛋白含有三种不同等电点的α、β、γ同型异构体。合成型细胞蛋白的组成为β、γ，收缩型则是以α为主，在平滑肌细胞分化增殖过程中分子量发生改变。肌球蛋白的重链也存在异构体，目前已发现分化成熟的平滑肌细胞肌球蛋白具有SM₁和SM₂两种异构体，在胎儿期，除含有SM₁外，还有其他型肌球蛋白。平滑肌肌球蛋白重链（SMemb）含有多种异构体，已被作为形态，性质改变的指标。

二、平滑肌肌球蛋白重链异构体在分化中的改变

兔大动脉内平滑肌肌球蛋白SM₁从胎儿期到成年是一致的。而SM₂则在新生儿后才出现。另外，有一种胎儿型平滑肌肌球蛋白在胎儿新生儿出现较多，年龄增长则逐渐减少。肌球蛋白量和质的变化是平滑肌细胞在分化过程中的主要变化。

在胎儿期肺动脉与主动脉相连，肺循环与体循环间相连的动脉导管的平滑肌显示特异的细胞性质，这一导管在婴儿出生后会自动关闭，虽然机制不明，但与平滑肌细胞肌球蛋白组成和性质改变有关。例如SM₂不存在于出生前的其他血管中，但却在动脉导管内存在，提示SM₂的变化是平滑肌细胞在分化中改变最明显的一个特征。

三、球囊导管损害模型与内膜平滑肌的改变

利用球囊导管制作的动物模型，平滑肌表现为类似胎儿期平滑肌特征。免疫学方法测定显示抗SM₁和抗SMemb阳性，抗SM₂阴性，说明球囊导管损伤血管后，平滑肌细胞内SM₂消失，平滑肌细胞由收缩型转变为合成型。电子显微镜下，血管损伤后的平滑肌细胞与胎儿平滑肌细胞极其相似。

四、人动脉硬化病变的基础

人类动脉硬化的发生与发展是经历数年或数十年的过程，开始表现为平滑肌的增殖和变性，然后泡沫化的巨噬细胞加速病变。人类动脉硬化有其自身特点，在10岁左右内膜平滑肌即开始增殖使内膜肥厚，但这种弥漫性肥厚（dittuseintimal thicking,TID）不同于浸润性的动脉粥样化硬化式的肥厚，弥漫性动脉内膜肥厚的动脉粥样硬化发生率也高。因此，弥漫性动脉内膜肥厚被认为是发生动脉粥样硬化的基础之一。

平滑肌肌球蛋白肌丝的抗体，对不同年龄人的冠状动脉的免疫组织学检测显示胎儿冠状动脉内膜阴性，而中膜阳性，说明肌球蛋白仅仅存在于中膜。胎儿早期（20周前）SM₂阴性。10岁左右内膜已经形成较厚的平滑肌层。这种内膜平滑肌SM₁、SM₂、SMemb抗体测定均为阳性，与中膜平滑肌没有区别。这种内膜平滑肌的增殖在开始时形成同心圆，到20～30岁时渐渐改变为偏心状，此时，内膜和中膜间质发生缓慢的增殖，但尚不存在增殖细胞，也不见增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性细胞及巨噬细胞，到40岁时，在接近中膜的内膜深部发生平滑肌细胞形态的变化，这种变化表现为SM₁、SM₂、以及α-肌动蛋白的消失。虽不明确原因，但肯定与巨噬细胞无关。平滑肌细胞数开始逐渐减少，而纤维化增加。在50～60岁时，内膜平滑肌细胞常常脱落，内膜纤维化显著增加。在纤维化的内膜层可见巨噬细胞的集积，但为数不多，这与冠状动脉硬化狭窄有显著不同，所以仍被看作是从青少年期开始弥漫性内膜肥厚的继续。

五、主动脉粥样硬化病变

主动脉粥样硬化病变表现为泡沫化的巨噬细胞大量集积，主动脉内膜肥厚，但组成内膜的细胞主要是巨噬细胞，泡沫细胞以及SM₂消失的平滑肌细胞。这一个病理变化过程如图所示11-2所示。

图11－2　内膜平滑肌增殖和巨噬细胞集积对冠状动脉的影响

综上所述，平滑肌细胞是参人动脉粥样硬化的主要细胞之一，其自身的变化特征是SM₁、SM₂的变化。

第三节　单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞在动脉硬化中的作用

随着细胞分子生物学的进步，已经基本明确了在动脉粥样硬化时各种细胞相互剌激与应答的关系。病变时期，单核细胞、巨噬细胞在向内皮下层入侵的同时摄取变性的LDL使其自身泡沫化。淋巴细胞则分泌多种生物活性物质，加速动脉粥样硬化进程。

一、巨噬细胞与动脉粥样硬化进程的关系

动脉粥样硬化与胆固醇代谢有关已成共识，这些脂质沉积于动脉管壁、巨噬细胞吞噬这些脂质并逐渐泡沫化，动脉内膜、中膜平滑肌细胞增殖形成粥样斑块（如图11-3）。这个过程与炎症时的免疫应答类似，巨噬细胞在这一病变过程中起着主导作用。

图11-3 泡沫细胞透射电镜照片

二、血管内皮细胞与白细胞的相互作用

在动脉硬化过程中，单核细胞吸附于内皮细胞，并向内皮下层入侵分化引起内皮细胞也发生相应变化。没有单核细胞吸附的内皮细胞，可以通过自身的调节作用发挥抗血栓形成，保持血管疏通，维持血流流动。但在单核细胞吸附或侵入时，自身调节作用减弱或消失，这是诱发动脉硬化发生的重要因素之一。

最初的动脉硬化机制假说认为血小板最先吸附于血管壁，但后来动物实验证实这一假说是错误的，是白细胞和淋巴细胞首先吸附在内皮细胞上。白细胞附壁之后不再游离，这与其分泌的几种粘附蛋白密切有关，这些粘附蛋白属糖蛋白类，现已知有血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1），极迟抗原-4（very late antigen-4,VLA-4），淋巴细胞作用相关抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFAA-1），这些因子可在白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）和内毒素剌激下由白细胞合成和释放。有人认为LDL（low density lipoprotein）过氧化物亦有诱导其分泌的作用。

白细胞吸附和人侵血管壁时，还会释放多种生物活性因子如巨噬细胞会释放肿瘤坏死因子（TNF）、IL-1、IL-6、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）、TGF-β等，T淋巴细胞合成和分泌干扰素-r（interferon-r,IFN-r）和集落剌激因子（colony stimulating factor,CSF）。同免疫反应一样，在动脉粥样硬化中，巨噬细胞和淋巴细胞进行了多种信息的传递和调控，其结果是平滑肌细胞和成纤维细胞增殖，细胞间质增厚（图11-4）。

图11-4 动脉粥样硬化灶内细胞间应答示意图

三、氧化型LDL在动脉硬化中的作用

已有许多证据说明低密度脂蛋白（LDL）被氧化后转变为氧化型LDL，这种变性LDL与动脉硬化有关，当脂质LDL在血液中蓄积时，被不明因素氧化，巨噬细胞对这种氧化LDL有极强的亲和力且无休止地摄取，导致巨噬细胞泡沫化。体内LDL的氧化修饰有几种说法，一般认为，它与胞内氧自由基产生有关，即细胞内产生的活性氧（O2-）能够氧化LDL。在动物实验中，口服丙丁酚能够抑制LDL氧化过程氧化LDL首先损害内皮细胞，继而使巨噬细胞泡沫化。有人认为它还能影响巨噬细胞花生四烯酸的代谢，又能诱发细胞释放多种生物活性因子，因此，被认为与动脉粥样硬化的各阶段密切相关，见图11-5。

图11-5　氧化LDL与动脉粥样硬化进展关系示意图

四、巨噬细胞泡沫化和脱泡沫化

巨噬细胞泡沫化是动脉硬化的一个重要因素，如果让泡沫化过程逆转对临床治疗动脉硬化有极其重要的意义。Goldstein认为氧化LDL促使巨噬细胞泡沫化的机制是巨噬细胞通过胞膜上氧化LDL受体，结合氧化LDL并转运至胞内，在胞内由溶酶体水解LDL，生成大量的游离脂肪酸和胆固醇。游离胆固醇在胆固醇酰基转移酶（ACAT）作用下与脂肪酸重新合成胆固醇酯贮存于细胞内。大量胆固醇酯等脂质的蓄积使胞内亚细胞器所占空间越来越小，被迫逐渐退化甚至消失-泡沫化。另一方面，存在于胞内的胆固醇酯可以被再分解成胆固醇和脂肪酸而反复循环，正常肝细胞可以通过这种方式调节体内胆固醇代谢。在细胞培养时，高密度脂蛋白（HDL）能够从巨噬细胞吸取游离胆固醇，由HDL转运到血浆，在卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）作用下催化生成胆固醇酯，后者被胆固醇酯转运蛋白（CETP）送至VLDL和LDL，由肝细胞摄取并代谢。HDL与巨噬细胞的相互作用机制尚不清楚，但可以肯定HDL能够阻止巨噬细胞泡沫化，从而阻止动脉粥样硬化。将HDL氧化形成氧化HDL后，后者能抑制HDL从巨噬细胞吸胆固醇，提示不仅是氧化LDL，氧化HDL也能促进动脉硬化的发展，见图11-6。

图11-6 巨噬细胞脱泡沫化与胆固醇的逆转运机制示意图

与炎症反应相比，动脉粥样硬化过程同样有多种免疫细胞参人，这些细胞及其释放的各种活性因子相互作用，形成血管硬化和抗硬化的复杂过程，要完全阐明这一过程，仍有待进一步研究。

第四节　细胞因子、游走因子、生长因子的作用

如前所述，多种免疫细胞参与了动脉粥样硬化过程并发挥重要作用，但很多作用是通过具有生物活性的细胞因子来实现的。本节以平滑肌为目标，叙述在硬化灶形成过程中主要的相关因子即细胞因子、游走因子和生长因子的作用，见表11-1。

一、细胞因子及其作用

1．血小板分泌的生长因子

由血小板分泌的生长因子（platelet-derived growthfactor,PDGF），因首先发现于血小板而得名，后来发现多种细胞能够合成和分泌PDGF，PDGF由A、B两条链组成，有AA、AB、BB三种存在形式和两种类型的受体（α和β受体）。在凝集的血小板、向内皮浸润的巨噬细胞、凝血酶及血流切力剌激下，内皮细胞能分泌PDGF-AA、AB、BB，平滑肌细胞可分泌PDGF-AA。由内皮细胞分泌的三种PDGF能促进平滑肌细胞的增殖，其活性依次是BB＞AB＞AA。AB、BB还能促进平滑肌游走，而AA则不具有这一功能，相反还有抑制作用。所以一般认为PDGF-AB、BB是促进病灶形成因子，PDGF-AA是抑制因子。

2．平滑肌细胞分泌的游走因子

老鼠和家兔的平滑肌细胞能够分泌促进平滑肌游走的因子（SMC-derivedmigration factor,SDMF）。SDMF具有很强的活性，其活性数倍于PDGF。SDMF是分子量为58kD的碱性蛋白质，对平滑肌游走作用很强。但它不能使内皮细胞游走，也不具备剌激平滑肌细胞增殖的活性。位于内膜肥厚灶内的平滑肌细胞具有很强的合成和分泌SDMF的功能，SDMF促使平滑肌细胞游走，所以它被看作是病灶形成促进因子。

3．成纤维细胞生长因子

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）有几种异构体，在动脉硬化灶中起作用的主要是bFGF（basic fibroblast growth factor），bFGF可以由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌。它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走。能够促使新血管形成，修复损害的内皮细胞。FGF被认为是病灶形成促进因子，但从修复角度看它也有有利的一面。

4．平滑肌细胞分泌的生长因子

家兔的平滑肌细胞能够分泌一种新的生长因子（SMC-derived growthfactor,SDGF），SDGF不同于PDGF和FGF，在细胞培养初期，原代平滑肌细胞不分泌SDGF，加入血清经传代培养后则可产生SDGF。巨噬细胞和内皮细胞能促进平滑肌细胞SDGF的分泌。SDGF与其他细胞分泌的生长因子共同促使平滑肌细胞增殖，但对内皮细胞没有作用。SDGF被认为是病灶平滑肌细胞分泌的一种自分泌生长因子。

5．转化生长因子

转化生长因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）可由血小板、巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞分泌。一般以无活性的形式分泌，它的激活对细胞自身功能调节起重要作用。在酸性条件下，可被蛋白酶活化。它能抑制平滑肌细胞和内皮细胞的游走和增殖，对其他细胞则促使其细胞外间质的合成。TGF-β分泌、活化以及作用机制复杂，在动脉硬化灶形成过程中有何作用淍无定论。

表11-1 平滑肌细胞游走和增殖的相关因子

（—）无效果；？：未进行研究

二、自分泌途径对平滑肌细胞机能的调节

自分泌途径即细胞通过分泌一些因子调节自身活动的过程。动脉硬化过程中，有许多细胞具有这一功能，尤其以平滑肌细胞最为最着。在内膜肥厚灶内平滑肌通过分泌SDMF和SDGF，促使自身从中膜向内膜游走并增殖。这对病灶形成有极其重要的作用。除此之外，平滑肌细胞还分泌PDGF-AA、TGF-β，抑制自身的增殖和游走。这种促进因子和抑制因子相互制约，决定病灶发展的方向，对临床诊断治疗有很重要的意义。

三、细胞因子对动物模型作用的讨论

以球囊导管损伤动物动脉血管壁，制作动脉粥样硬化模型，最初的反应中，中膜平滑肌一过性地增殖，在损害后的1～2周内终上。随后，平滑肌细胞开始从中膜向内膜游走，渐渐地内膜肥厚处大部分为游走的平滑肌细胞和自身增殖的细胞，各占1/2，由此可知游走和增殖的重要性。损害2周后，平滑肌细胞分泌激肽等因子，细胞间质开始过剩合成。

对这一动物模型给予不同的细胞因子，结果显示：PDFG-BB有促进内膜肥厚作用，但在体外实验时PDGF-BB与平滑肌的游走和增殖无关，在这一实验中，也仅见有促进增殖作用，不具促游走作用。加PDGF-AA后，可见内膜肥厚被抑制，可见PDGF-AA有抑制游走作用。给予bFGF时，它可促进中膜和内膜增殖，对细胞间质则没有作用。给予干扰素（IFN-γ）时，它能强有效地抑制内膜肥厚，即使10周后仍有较强的作用。TGF-β在细胞培养时表现抑制平滑肌细胞游走和增殖的作用，但给予动物时则显示促进作用，对这一现象尚无解释。

总之，在动脉硬化灶内存在多种细胞群、多种因子与平滑肌细胞的游走和增殖及动脉硬化病灶的形成有关。在这节中，涉及的只是一部分细胞和因子，有很多因子的作用并不清楚，也还有许多因子有待研究和发现，如最近发现了一些因子的遗传基因，这将有助于对这些因子的研究，为研究这些因子提供一个新的方法，也必将推进动脉粥样硬化研究的深入。

（黄俊军 周　新）

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第十二章　动脉粥样硬化

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是指动脉内膜的脂质、血液成分的沉积，平滑肌细胞及胶原纤维增生，伴有坏死及钙化等不同程度病变的一类慢性进行性病理过程。AS包括粥瘤（atheroma）和硬化（sclerosis）两层涵义，前者指脂质沉积坏死所形成的粥样病灶，后者指胶原纤维增生，AS是心脑血管系统中最常见的疾病之一，严重危害人类健康，其并发症是西方工业发达国家的主要死亡原因之一。近年来，本病在我国亦有明显增加的趋势。

第一节　病理特征

动脉粥样硬化主要损伤动脉壁内膜，严重时累及中膜。最常受累的是主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉及周围动脉等。组织病理学的研究证明，AS都有内皮细胞的损伤，平滑肌细胞的增生和内膜下迁移，单核/巨噬细胞的浸润和增生，成纤维细胞的增生和内膜下迁移，形成泡沫细胞，细胞坏死和大量的脂肪沉积，如图12-1所示。

图12-1 动脉粥样硬化斑块电镜图

67岁的男性病人粥样硬化动脉破损的内膜。可见球型颗粒（脂质）从深达几层纤维蛋白的动脉粥样粉瘤中释放出来。

AS病变特点主要有以下几项：①局灶性病变常发生于动脉分叉处；②病变始发于内皮细胞功能性的改变；③病变最主要的细胞为平滑肌细胞；④病灶随严重程度不同在细胞内外有不同脂质，其中主要为胆固醇。根据病变的发展经过可将其分为以下5个时期：内膜水肿；脂纹和脂斑；纤维斑块；粥样斑块；粥样斑块的继发性变化（斑块内出血；粥瘤性溃疡；血栓形成；钙化；动脉瘤形成）。

免疫组化分析证明，早期脂纹区域主要是含胆固醇酯的巨噬细胞和一些T淋巴细胞。纤维斑块包括平滑肌细胞和巨噬细胞，病变发展为多层的增生的平滑肌细胞、充满脂质的巨噬细胞以及含脂质的平滑肌细胞、一些T淋巴细胞、胆固醇结晶、坏死碎片和钙盐。动物实验研究AS形成的过程显示：最先改变为单核细胞和T淋巴细胞附着于动脉壁内皮并向内皮下迁移。在内皮下单核细胞聚集脂质并成熟变成含脂质的巨噬细胞，此时成为脂纹病变。以后发生内皮断裂，血小板粘附，平滑肌细胞增生。

脂纹逐渐纤维化变成成分复杂的斑块。由于纤维斑块出血、钙化、细胞坏死而导致复合性病变的形成。

脂纹症状的发生是由于粥样硬化斑块使通过该动脉的血流量减少，使远端组织或器官发生缺血性损伤。主动脉受累严重，尤其是腹主动脉，但因管腔粗，不易引起阻塞症状。冠状动脉与脑动脉则因管较细，由于激发条件而引起斑块表面溃疡、内出血、血小板进一步凝集、血栓形成、动脉管腔狭窄或阻塞，从而导致冠心病（CHD）与缺血性脑卒中（ICVD）的发生。

第二节　病因与发病机制

根据对来自AS的缺血性心脏病、脑梗塞等病人生活习惯，生活方式及身体异常状态等方面调查，提示其主要危险因素有：①高脂症；②高血压；③吸咽；④性别；⑤内分泌因素；⑥遗传因素等。研究发现，上述危险因素中高脂血症、高血压、吸烟是促进AS发病全过程的三大主要因素。AS病因绝非一种因素所致，可能为多种因素联合作用引起。

动脉粥样硬化发病机制至今尚未阐明，主要学说有：

1．脂源性学说：高脂血症可因内皮细胞损伤和灶状脱落。导致血管壁通透性升高，血浆脂蛋白得以进入内膜，其后引起巨噬细胞的清除反应和血管壁平滑肌细胞增生，并形成斑块。Anitschkow（1925）的浸润学说，r Ossle（1943）的渗入学说，以及Doerr（1963）的灌注学说都是在此基础上建立并互为补充的。

2．内皮细胞损伤学说：Ross等认为AS斑块形成至少有两个途径①各种原因引起内皮细胞的损伤破坏和由此引起的血小板凝集，活化，可导致血小板分泌血小板源性生长因子（PDGF），促进平滑肌细胞增生。②内皮细胞受损，但尚完整，内皮细胞或巨噬细胞均能分泌增生因子，平滑肌及受损内皮也可产生PDGF样生长因子，这种相互作用导致纤维斑块形成，并继续发展。

3．受体缺失学说：Goldstein和Brown(1997)研究证明，机体的细胞含有特殊的LDL受体。细胞的LDL受体数目依细胞对胆固醇的需要而增减，从而保证了细胞不摄入过多的胆固醇；但若LDL受体数目过少，则可导致细胞从循环血中清除LDL减少，从而使血浆LDL升高。通过非受体途径和化学修饰的LDL受体，使巨噬细胞摄入大量胆固醇酯而形成泡沫细胞。

4．细胞因子学说：动脉壁细胞和参与AS形成的某些血液细胞在一定条件下均可合成分泌多种细胞因子。每一种细胞因子在AS进程中的作用是相当复杂的。目前发现白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF）有促进AS形成作用；干扰素（IFN）有抑制AS形成作用。集落剌激因子（CSF）对AS的形成存在正反两方面的调节作用。细胞因子间通过相互诱导、相互协同或拮抗作用参与AS的形成。

5．病毒学说：研究表明病毒感染可能通过对内皮细胞的损伤和/或改变宿主细胞脂质代谢过程触发AS的产生以及加速其形成，并通过诱导宿主细胞的转化，活性介质的释放引起血管平滑肌细胞的增生，从而形成AS的典型病变。主要病毒是疱疹科病毒，包括巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV₁和HSV₂）EB病毒等；乙肝病毒（HBV）；柯萨奇病毒（CV）；受滋病毒（HIV）等。

6．癌基因学说：AS的发生发展中有癌基因的参与，如在AS斑块中有sis,myc,fos等癌基因的异常表达。某些诱发AS的因素如内皮细胞损伤、凝血酶、高胆固醇、脂多糖和一些细胞因子（IL-1、IL-6，TNF，IFN，CSF）等亦可促进癌基因的表达。它们的产物有的是生长因子，有的是核内调节蛋白。癌基因的异常表达，导致细胞生长、增殖和分化失调，引起AS的形成。

AS是一多因素引发的疾病。它的形成和发展受许多因素的制约，既包括与脂蛋白代谢有关的基因，也包括环境因素的影响。由于AS病因复杂，病变发生较慢且在早期无症状，故对其病因和发病机制的研究进展仍然较慢。如图12-2所示AS发生机理假说。

图12-2 动脉粥样硬化的发病机制（假说）

目前就AS的发病机制较一致的看法包括：①在易损部位内膜血浆脂蛋白的内流和聚集；②局部内膜单核细胞-巨噬细胞修复；③在内膜通过平滑肌细胞、巨噬细胞和内皮细胞而形成一系列的活性氧或自由基团；④内膜脂蛋白通过活性氧形成氧化修饰，产生一系列氧化修饰脂蛋白，例如氧化LDL（Ox-LDL）和脂蛋白（a）[Ox-Lp（a）]；⑤通过非下调巨噬细胞清道夫受体或多种受体摄取氧化修饰的脂蛋白而形成泡沫细胞；⑥泡沫细胞坏死最可能是由于氧化修饰的LDL的细胞毒作用；⑦平滑肌细胞移至动脉内膜并增殖，PDGF被认为起着化学吸引的作用。纤维母细胞生长因子可能调节平滑肌细胞增殖；⑧斑块破裂主要在巨噬细胞最密集部位。通过巨噬细胞释放的蛋白水解酶可激发斑块破裂，最终导致附壁的阻塞性血栓形成；⑨自身免疫炎症可能是由于O_x-LDL顶端表皮的抗原性所致。

近年来对于AS病因的发病机制的研究热点在于内皮细胞损伤因素如何使动脉失衡；各种细胞因子对病变发生发展的影响或调控；脂蛋白、载脂蛋白及脂蛋白受体相关基因的结构或表达的异常在AS发生发展中的作用等等。特别是从基因水平探讨其发生机理，必将对其预防或治疗产生重大突破。

第三节　自由基与动脉粥样硬化

自由基是指外层轨道上不配对电子的原子、分子或基团，包括超氧阴离子（O₂^-或H₂O^-）、羟自由基（^-OH）、单线态氧（¹O₂）、过氧化氢（H₂O₂）、脂质过氧化物（RO^-、ROO^-与ROOH）等。正常情况下体内产生少量自由基属正常生理范围。体内同时存在超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POX）等可清除这些对细胞有毒性作用的自由基，故体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态。

近30年来，随着氧自由基（oxygen free radical.OFR）及其介导的脂质过氧化反应在疾病中的作用研究日趋深入，自由基与冠心病、动脉粥样硬化发生发展相关的事实正在不断增加，对其损伤机制的认识亦更趋深化。大量基础研究表明，高血脂时体内自由基产生和清除平衡波破坏，许多自由基清除剂（如SOD、CAT）活性降低，产生大量的脂质过氧化物（LPO），这些LPO与AS的形成密切相关。其机制表现为：LPO直接损伤内皮细胞，导致内皮细胞的退行性变化和通透性改变，LPO的产物丙二醛（MDA）极易修饰低密度脂蛋白（LDL），成为MDA-LDL后，能为单核巨噬细胞受体所辨认、内饮，而形成泡沫细胞；炎性细胞浸润并释放各种生长因子，剌激中膜平滑肌细胞移行于内膜增生，吞噬及分泌大量间质成分，形成AS；LPO引起前列环素/血环素A₂（PGI₂/TXA₂）失调，血小板聚集性加强，释放5-羟色胺（5-HT）等，并增强凝血活性。这些因素间又相互影响，相互作用，从而促进AS的形成。分子生物学的最新研究发现，AS病灶中内皮细胞、平滑肌细胞及单核细胞的SiS基因表达明显增强。Gadiparthi等实验发现自由基剌激血管平滑肌细胞的增殖，参与了原癌基因的激活及异常表达，从此基因水平揭示了氧自由基与AS之间的密切关系。

此外，LDL经过多种类型的细胞、过渡金属离子或脂加氧酶的氧化修饰产生氧化修饰LDL（O_x-LDL），Steinberg等从细胞产生氧自由基的角度提出细胞氧化LDL的可能机制（图12-3）。

图12-3 细胞氧化修饰LDL的可能机制

O_x-LDL促进AS发展可能通过下述几条途径：①通过乙酰LDL受体（即清道夫受体）途径促进泡沫细胞的形成；②LDL氧化修饰过程中所产生的LPO能抑制HDL的合成，削弱了HDL介导外周组织胆固醇的逆转运，不利于泡沫细胞的消退；③O_x-LDL有细胞毒作用，可损伤内皮，使内皮脱落，进一步引起血栓形成等后果；④O_x-LDL中具有趋化性的脂质使血液中的单核细胞粘附至内皮，进而穿过内皮，进入内皮下间隙；⑤O_x-LDL中对巨噬细胞有抑制作用的脂质阻碍了巨噬细胞的游出，使之聚集在内膜中而有利于AS的形成，此外，O_x-LDL还能直接引起血小板的聚集，促进血栓的形成而有利于AS的发生与发展。

现有资料提示，提高如SOD、CAT等清除自由基酶类的水平，应用药物阻滞LDL的氧化可抑制AS的发生并改变病损的进展。某些研究显示，普罗布可（Probucol）是一种强力的脂溶性抗氧化剂或自由基清除剂。实验说明，该药有延缓泡沫细胞发生的能力，病变部位单核细胞的粘附力降低和进入内膜下间隙的数量明显减少。Probucol类似物、丁羟甲苯及多聚不饱和脂肪酸也不相似的作用。膳食中的抗氧化剂，维生素E与维生素C已肯定潜在的辅助治疗作用，能保护体内LDL免遭氧化修饰从而阻止或延缓SA的发生、发展。由于自由基与AS的形成密切相关，进一步从分子水平，基因水平揭示自由基在AS发生、发展过程中的作用，必将有助于一些困扰临床工作者的诸如再灌注后心肌损伤、心律失常、心力衰竭、脑梗塞等严重问题。为心脑血管病治疗的进一步完善提供新途径。

第四节　脂蛋白代谢紊乱与动脉粥样硬化的相关性

脂蛋白是一类复合物，由各种脂质和蛋白质组成，其主要功能是运转外源和内源和内源性的脂类物质到血液中。脂蛋白代谢过程中包括五种脂蛋白，即：乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）中间密度脂蛋白（IDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。其中HDL又分为两个亚类即HDL₂和HDL₃。若一种或几种脂蛋白的结构和代谢发生异常，则可能引起AS。

控制脂蛋白代谢和转运的主要有①载脂蛋白（Apo），包括AⅠ、AⅡ、AⅣ、B₁₀₀、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E和Apo（a）；②脂蛋白酶类，包括脂蛋白脂肪酶（LPL）、肝脂酶（HL）、胆固醇转移蛋白（CETP）或称脂质转运蛋白（LTP）、卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）；③脂蛋白受体，包括LDL受体（LDL-R）、乳糜微粒残粒（CmRmnant）受体、清道夫（scavenger）受体。编码这些蛋白质的基因和cDNA均已分离出，并被测序及标出其在人类染色体上的位置。这些基因在人体内部是单拷贝的，通过研究证明这些基因的结构或表达异常与AS易感性有密切关系。根据现有的研究资料，可以把群体中经常发生的脂蛋白代谢紊乱分为以下几种类型：

一、LDL-C水平升高

ApoB、ApoE和LDL-R基因变异可导致LDL-C水平增加。ApoB₁₀₀主要存在于LDL中，VLDL、IDL和Lp（a）中也有ApoB₁₀₀。ApoB₁₀₀可识别LDL受体，介导LDL的摄取。ApoB基因全长43Kb，含有29个外显子和28个内含子，编码ApoB₁₀₀多肽链，其中包含27个氨基酸的信号肽和4536个氨基酸的成熟肽，人肝脏主要合成B₁₀₀，小肠合成B₄₈，与LDL-R的结合区域位于该蛋白的羧基未端。ApoA基因最普遍的变异是单个碱基替换和小片段的缺失，导致形成不完整的肽段。ApoB基因突变可导致血浆ApoB和LDL水平升高伴早发冠心病。目前已发现有20余种不同ApoB基因突变引起低β或Beta脂蛋白血症。ApoB基因变异也可引起高胆固醇血症。ApoB基因第26个外显子中第10708位的G为A取代，使第3500位的谷氨酰胺变为精氨酸，这个氨基酸残基的取代大大减弱了ApoB₁₀₀与LDL-R的亲合力，导致临床上出现高胆固醇血症。

ApoE是中等分子量的载脂蛋白，主要存在于VLDL、CM、Cm Remnant和某些HDL亚型中，作为脂蛋白和配体发挥作用，通过受体介导途径参与机体脂质代谢调节。人ApoE基因全长3597bp，包括4个外显子和3个内含子，相对应的mRNA由1163个核苷酸组成。ApoE基因变异是影响LDL-C水平的另一遗传因素。ApoE具有明显遗传多态性，同一位点的三个共显性等位基因ε₂、ε₃、ε₄分别编码三种主要ApoE异构体E₂、E₃、E₄。ApoE₂与受体的结合活性只相当于E₄和E₃的1%～2%，使含ApoE及富含胆固醇的脂蛋白代谢胺受阻,Cm Remnant及VLDL残粒在血浆中堆积，并早发AS。群体研究表明，具有E4/3表型的个体LDL-C水平比具有E3/3表型的个体高0.26～0.52mmol/L，而具有E3/2表型的个体则低于E3/3表型个体约0.26～0.52mmol/L。

LDL-R主要在肝脏表达，因ApoB、ApoE均可作为LDL-R的配体，所以LDL-R也称ApoE受体。近乎75%的循环LDL由肝脏清除而其中90%以上是靠LDL-R途径，即LDL-R在调节胆固醇代谢中起重要作用。人LDL-R基因全长45Kb，该基因含18个外显子，17个内含子，编码866个氨基酸的多肽。LDL-R基因变异极大地影响LDL-C水平，该基因的变异是家族性高胆固醇血症的主要原因。已经鉴定的LDL-R基因变异有40多种，其人群发生率约1：5000。基因变异的种类可自大片段的缺失和重排（约占50%），或仅仅是单个碱基的替换，导致形成错误的或无意义的密码。

二、HDL水平降低和TG水平的升高

ApoAⅠ、LCAT和CETP基因变异引起了HDL-C与TG水平变化。ApoAⅠ主要存在于HDL中，可识别HDL受体（HDL-R）并与LCAT协同作用。人ApoAⅠ基因全长1.8Kb，与ApoCⅢ、AⅣ基因形成紧密的基因簇，位于染色体11长臂2区。这一基因簇中任一基因的变异都可能引起ApoAⅠ的缺失。一般讲，大片段缺失或重排可能出现极低的ApoAⅠ和HDL-C水平以及早发性AS。ApoAⅠ基因的无意义突变也引起低HDL-C水平。

LCAT是由肝脏合成分泌的一种糖蛋白，其载脂蛋白的转化和胆固醇的逆向转运中具有主要作用。LCAT的转脂活性主要与HDL相关。ApoAⅠ是LCAT反应的主要激活剂。最近研究发现LCAT缺乏是由于该基因突变引起的，其中一种疾病叫鱼眼病也由于LCAT多种形式变异的结果。如在LCAT基因第123位苏氨酸变为异亮氨酸（Thr₁₂₃→Ile）和第347位苏氨酸变为蛋氨酸（Thr₃₄₇→Met）的两个等位基因点突变就可引起鱼眼病。

CETP是一种由476个氨基酸多肽组成的酸性糖蛋白，含有丰富的非极性氨基酸。血浆CETP参与胆固醇逆向转运，介导和调节胆固醇脂（CE）的运转过程。人CETP基因约25Kb，含16个外显子和15个内含子。在CETP基因中第14内含子的第1个核苷酸的点突变破坏了基因转录过程中的正常剪切。因此，带有这种变异的纯合子个体在其血浆中检测不到CETP，而杂合子个体血浆中大约只有正常个体CETP水平的60%。CETP缺乏引起HDL-C升高也已证明。因此像低β脂蛋白血症一样，CETP缺乏可能是抗动脉硬化而发生一种变异。

此外，LPL和HL基因变异也影响HDL-C与TG水平。LPL能将循环中TG水解为游离脂肪酸和甘油，有助于游离脂肪向周围组织转运，在VLDL和LDL的转化中也起作用。现已报告的LPL遗传缺陷有20余种，LPL基因发生多种形式变异可造成LPL水平降低，酶活性缺陷或降低，导致血浆TG水平明显升高，HDL-C水平降低，形成高TG血症（Ⅰ型高脂血症）。HL除水解TG外，还有助于HDL₂转化为HDL₃而影响HDL的代谢。HL基因突变造成HL活性降低或缺失，可使血浆胆固醇及TG升高，也促使早期AS形成。最近，在两个高α-脂蛋白血症个体中检查到ApoCⅢ基因结构变异，其血浆中CⅢ浓度较低，HDL颗粒大小呈非典型状。

三、Lp（a）水平增高

Lp（a）与LDL结构类似，其除含有LDL的成分（胆固醇、磷脂和ApoB₁₀₀）外，还有一种特殊的抗原性成分Apo（a），Apo（a）与ApoB₁₀₀以二硫键相结合。大量流行病学调查显示，Lp（a）浓度升高与冠心病、心肌梗塞、脑卒中、血管再狭窄等密切相关，是AS的独立危险因素。Apo（a）的氨基酸组成及基因结构与纤溶酶原（PLG）极其相似，具有高度同源性。PLG含有5种称为Kringle的环状结构区（Kringle1-5），其后是一个丝氨酸（Ser）蛋白酶区。而Apo（a）含有一个与PLG相似但又不完全相同的疏水信号肽区，其后为10～40个类似Kringle4区，1个类似Kringle5区及一个变异的蛋白酶区。Apo(a)分子具有显著多态性，其产生的分子基础是由于基因中Kringle4结构重复的数量差异所致。同一个体，Apo（a）表型分子量与血浆Lp（a）浓度呈负相关，均受Apo（a）基因控制。血浆中Lp（a）数量和Apo（a）表型分子量以及Kringle4区域重复结构的数目呈负相关。Lp（a）可能通过干扰LDL和PLG代谢两个途径参与AS的形成和发展，可能在血栓形成与动脉粥样硬化之间起桥梁作用。

解释引起血浆中血脂、脂蛋白和载脂蛋白的水平变化的原因，还有很多的工作需要深入，还有一些控制着细胞内胆固醇代谢和吸收的新基因有待发现，另一些新的基因位点可能需要利用反向遗传学技术才能加以揭示。因此，研究脂蛋白代谢紊乱与AS相关性是一个有价值且极活跃的领域。

（鄢盛恺）

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第十三章　糖尿病高脂血症与动脉粥样硬化

第一节　糖尿病与动脉硬化

严重糖尿病常合并器官小动脉和神经损害。表现为细小动脉的硬化和特殊器官的功能衰竭，但动脉硬化并非糖尿病的特殊临床表现。本文主要就糖尿病的脂质代谢及其有关的细胞生物学等方面的相关关系作一概述。

统计糖尿病死亡的病因，占第1位的是动脉硬化为主体的病变。糖尿病发生动脉硬化的类型为门克伯型（Monckerg）硬化，这种硬化主要发生在肌性动脉，引起脏器的缺血而导致脏器损害。脏器缺血性损害主要是由粥样硬化引起，而糖尿病则是病因之一。研究糖尿病与非糖尿病动脉硬化的病理组织发现，在形态学的改变基本相同。糖尿病患者的动脉硬化又多发生于末梢血管，为什么有这种部位差异还有待于进一步研究。

一、糖尿病和脂蛋白代谢异常

糖尿病患者由于胰岛素不足或增高引起各种类型的高脂血症，或者血清脂质水平正常，其运输脂类的脂蛋白异常（如LDL增高）都可引起和促进动脉硬化的形成，糖尿病人高甘油三酯代谢如图13-1所示。糖尿病时血中TG、VLDL增加，并且有脂蛋白组成成分含量的变化，这种变化与参与代谢的酶以及受体的关系，使其进一步导致脂蛋白代谢的失调。糖尿病时LPL活性降低，从而使CM、VLDL的甘油三酯含量增高而促使血中LDL浓度增加，LDL可以通过泡沫细胞的产生，而促进动脉硬化的形成。

图13-1　糖尿病与高甘油三酯血症

二、糖尿病性动脉硬化的特点

糖尿病的代谢异常主要是胰岛素的不足和血糖增高所致，病理表现在特殊的器官出现小动脉硬化。目前认为，糖尿病出现动脉硬化的直接原因是糖化蛋白的出现以及细胞内间质萄聚糖过量表达等因素所导致的结果。

1．细胞外的变化-糖化蛋白的出现

体内蛋白（氨基酸），在非酶作用下与糖结合的产物称为糖化蛋白，典型代表为HbAIC，这一反应过程称为Maillard反应，如图13-2所示。

图13-2 Maillard反应（前后两阶段）与AGE结构体

糖化蛋白的反应分为前期阶段和后期阶段，前期阶段中，糖的醛基与蛋白质的氨基酸进行非酶促反应，形成席夫氏碱（schiff base）属于酰胺物生成阶段，为可逆反应。进而变成稳定的高级糖基化终产生（advancedglycosylation end product,AGE），此为后期阶段。AGE物质包含有吡咯醛（pyrrole aldehyde）、戊苷糖（pentosidine）和交联体[crosslinesA(B)]。体内各种蛋白质均有可能被糖基化，而改变其功能。

细胞外的血红蛋白最易糖基化，各种糖化蛋白的共同点是使代谢速度减慢，唯一例外是糖化HDL则使代谢速率加快，促成细胞间质（特别是胶原纤维、弹性纤维等）、凝血纤溶系统有关蛋白机能改变。

糖化LDL使其与LDL受体的结合率降低，代谢速度延缓。据此推测，糖基化的介入，使胶原纤维结合性增强，从而易沉积在细胞间质。HDL从细胞内将胆固醇转移出来（脱泡沫化作用）以及防止细胞摄取胆固醇过多（抗泡沫化作用），从而防止动脉粥样硬化的形成，成为抗动脉粥样硬化因素。ApoAⅠ是HDL受体的重要配体，属于清除胆固醇作用的颗粒，HDL糖基化成糖化HDL后，其清除胆固醇作用能力降低，这是因为ApoAⅠ作为配体的机能经糖基化后而减弱。

另外，糖化反应可生成超氧化物，在微量铁和铜等金属离子存在下，生成羟自由基并可切断DNA，使其表达的脂蛋白中的蛋白质变性、交联和断裂并引起脂质过氧化。高浓度胆固醇条件下进行氧化反应还可使胶原纤维交联。随糖化脂蛋白反应进行的同时可使超氧化物羟自由基进一步促成过氧化脂质及氧化脂蛋白生成。一旦LDL糖基化，生成氧化LDL，则糖尿病状态更容易出现，LDL的糖基化反应可被超氧化物歧化酶（SOD）抑制，从而消除氧自由基对LDL的糖基化作用。

巨噬细胞膜上存在有对AGE特异结合的部位（AGE受体），属于一种可被醛基修饰的蛋白质。检查AGE受体亲合力结果发现，AGE受体具有特异识别修饰蛋白的作用。AGE受体的生理机能，并非单纯介导洗除AGE，也参与介导分泌各种细胞因子，这些因子具有类似血管箭毒碱的作用，与微循环调节有关系。经实验证明，AGE修饰的牛血清白蛋白（BSA）具有促进单核和泡沫细胞的移动，对血管内皮存在的AGE受体及AGE-BSA血管透性均有影响。

2．细胞内的变化

糖尿病由于胰岛素的不足，糖酵解代谢速率降低，血糖浓度增高，山梨醇代谢旁路活性加强。因酶的诱导作用，醛糖还原酶活性增加，从6-磷酸葡萄糖生成山梨醇增加，山梨醇在山梨醇脱氢酶的作用下转变为6-磷酸果糖。醛糖还原酶（aldose reductase,AR）活性与葡萄糖浓度成正相关。但山梨糖醇脱氢酶（SDH）活性变化不大。细胞内山梨糖醇浓度增多，使细胞渗透压升高，细胞机能下降，出现蛋白变性，眼组织则出现白内障，这些改变均属于细胞内的代谢变化。动脉壁细胞特别是平滑肌细胞的山梨糖醇的沉着与动脉硬化形成是否有一定的关系还有待于进一步研究。

三、糖尿病性动脉硬化与免疫的关系

动脉壁硬化中的泡沫细胞来源于单核细胞和巨噬细胞，最近的实验证明也有淋巴细胞参与其中。但对免疫细胞的T淋巴细胞在动脉壁中出现的意义还未完全明了。巨噬细胞在形成泡沫细胞过程中分泌液体细胞因子，在T淋巴细胞与巨噬细胞共存的条件下，加速巨噬细胞胆固醇酯的合成，从而影响巨噬细胞的脂质代谢。在糖尿病时，脂蛋白（特别是LDL）可与其相应抗体结合而形成复合物，并且可使复合物氧化或糖基化，在红细胞、淋巴细胞、内皮细胞、细胞分泌的细胞因子以及粘着分子共同参与下促进粥样硬化的形成，如图13-3所示。

四、糖尿病时血管平滑肌细胞的特征

大鼠实验证明，糖尿病时血管平滑肌细胞表面的PDGF-β受体过度表达，使该细胞增殖明显加快，糖尿病组比非糖尿病组增殖显着增强，细胞因子分泌增多。对此，可以认为糖尿病代谢异常是使细胞因子分泌异常而导致平滑肌细胞增殖加快。

动脉粥样硬化的研究是从脂质代谢以及与代谢相关的诸因素的研究开始的，这些因素对阐明硬化的形成起着重要作用。糖尿病动脉硬化有哪些特点。又有哪些特殊因素参加，是急待解决的难题之一。

图13-3 动脉硬化疾病机制中的免疫反应（假说）

LDLIC：LDL免疫复合物；粘着分子：ELAM-Ⅰ、VCAM-Ⅰ、ICAM-Ⅰ、athero-ELAM。

第二节　高血脂与动脉硬化

随着饮食习惯的改变，缺血性心脏病发病率在逐年增加。流行病学调查表明，血清胆固醇水平升高，与粥样硬化呈正相关。其发病率与血清胆固醇呈正相关。与HDL-C呈负相关，与血清甘油三酯的关系尚无定论。

动脉粥样硬化初期，首先是内皮细胞受到损害，原因未明。高脂血症时，各种脂蛋白在血液中滞留，其间可能有脂质过氧化并参与内皮细胞的损害。用氧化脂蛋白抗体证明在粥样硬化灶内有氧化脂蛋白的存在；临床上用抗过氧化的药物可使家族性高胆固醇血症病人脂肪瘤变小。事实表明，高脂血症或脂蛋白血症的过氧化作用与动脉粥样硬化的成因密切相关。

一、原发性高脂血症种类

原发性高脂血症主要有以下几种：原发性高乳糜微粒血症；家族性高胆醇血症；家族性复合性高脂血症；内源性高甘油三酯血症；家族性Ⅲ型高脂血症；原发性高HDL血症。

二、动脉硬化的危险因素

原发性高脂血症是缺血性心脏病的危险因素之一。统计结果显示，心肌梗塞多数出现高脂血症伴有HDL-C降低。

动脉粥样硬化总的来说是遗传因素加上后天因素的疾患。Reaven认为动脉粥样硬化与胰岛素抵抗性、糖耐量异常有关，高胰岛素血症、高VLDL血症、HDL-C降低、高血压等因素属于代谢综合症X的概念（msyndrome X）。Kaplan等提出，上半身肥胖、糖耐量异常、高脂肪血症及高血压等为致命四重态度奏（deadly quartet）。这些因素相互作用、相互促进，可加快动脉粥样硬化的形成，单抽出某一个因素来考虑可能就无统计学意义。例如单独考虑胰岛素抵抗，代谢综合症X及致命四重奏的理论就不可能成立。

单纯脂肪组织过剩堆积的代谢紊乱与高血脂、高血压没有直接的关系，仅仅是属于脂肪分布异常症。只有在胰岛素抵抗出现的前提下，才考虑属于与动脉粥样硬化发生相关的代谢综合症X及致命四重秦。

通过冠脉造影确认的冠心病的患者观察，其中约25%为肥胖患者，它的内脏几乎都有脂肪过量堆积，并且表现为高血脂、耐糖量异常、高血压的综合异常。对不肥胖的患者进行脂肪分布分析，测量身高、体重，进行折算，与皮下脂肪相同厚度的正常人相比，内脏脂肪面积平均增加了2倍。从个人单个分析表明，体重正常者，内脏脂肪的堆积也是动脉粥样硬化形成的危险因素。

三、内脏脂肪的分子生物学

内脏脂肪细胞中脂肪储存有三个途径：①以乙酰COA为基质，经乙酰COA合成酶（ACS）催化合成中性脂肪；②由富含中性脂肪的脂蛋白在LPL参与下提供脂肪酸；③血浆葡萄糖经通道蛋白（channel protein）的葡萄糖转运蛋白（glucosetransporter,Glu T4）被摄取进入细胞代谢成乙酰COA，再合成脂肪酸，见图13-4。

图13-4 脂肪组织代谢图

内脏脂肪组织中，脂肪、糖的摄取、储存过程、能量代谢诸方面等更容易受遗传因素的影响。

四、结语

关于高脂血症导致动脉硬化的免疫学研究已有一定的成绩，但在其发生初期还有许多未知的难题。

动脉粥样硬化（缺血性心脏病等）存在着多种危险因素，如内脏脂肪集积、糖耐量异常、高脂血症、高血压等。内脏脂肪集积的过程如图13-5所示。

图13-5 内脏脂肪症候群代谢异常

（钱士匀）

（糖尿病高脂血症与动脉粥样硬化）参考文献

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第十四章　抑扬基因表达对脂蛋白代谢及动脉粥样硬化的影响

能够直接影响血浆脂质代谢的蛋白质至少有十八种，它们可划分如下三大类：

1．载脂蛋白类：包括ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、C、E和（a）等；

2．血浆脂酶类：包括脂蛋白脂肪酸（LPL）、肝脂酶（HL）、卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）和胆固醇酯转移蛋白（CETP）等；

3．受体类（receptors）：包括有低密度脂蛋白受体（LDL-R）、乳糜微粒残粒受体、清道夫受体、以及低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）等。

近十年来，编码这些“脂质相关蛋白质”的各个基因已相继由不同的实验室分离和克隆，所有这些基因在人类基因组中均为单拷贝。流行病学调查和临床观察发现人类异常脂蛋白血症和动脉粥样硬化的发病与这些基因中的某个基因或几个基因联合突变有着密切联系。为了探索异常脂蛋白血症和动脉粥样硬化发病的分子机制，二项新的分子生物学技术被应用于这一研究领域：一个是转基因技术（transgenic technique），将上述各个基因分子别或联合一起整合到动物的基因组内，导致这种动物高效率高产量地表达某一个或几个基因，从而建立一系列“转基因动物”模型，主要是转基因小鼠（rtanstgenicmice）。这种“转基因”技术主要是通过“微注射”（microinjection）或反转病毒（retrovirus）感染的方式将人或某种动物的编码某一“脂质相关蛋白质”的基因移植到小鼠胚胎干细胞（embryonal stem cells）内，从而达到增强表达（overexpression）的目的。另一项分子生物学技术称为基因剔除（knockout）技术，运用同源重组原理，将动物内源性某一个或几个编码“脂质相关蛋白质”的基因分别剔除或摧毁，导致这种基因的表达低于正常状态或甚至完全不能表达，因而建立“基因缺陷或缺乏动物”模型。运用这一套抑扬基因表达的策略，观察所引起的脂蛋白代谢变化和对动脉粥样硬化发生、发展及转归的影响，人们对异常脂蛋白血症和动脉粥样硬化发病机制的认识得到了相当程度的扩展、更新和修正。

冠心病的发病呈现显著性的家族遗传倾向，认识各个基因对脂蛋白代谢调控的分子机制，能够为动脉粥样硬化的基因治疗奠定理论基础；建立相应的基因检测手段，早期、及时地检测和监控这些与脂蛋白代谢有密切关连的基因表达状态，对于异常脂蛋白血症和冠心病的预测、预防、诊断、治疗和预后等工作，极具参考和指导意义。

第一节　载脂蛋白基因表达的抑扬

一、ApoAⅠ

ApoAⅠ是HDL的主要蛋白，占HDL总蛋白的70%。1989年由美国Breslow实验室首先将编码人类ApoAⅠ的基因分别整合到小鼠及大鼠的基因组内。ApoAⅠ在小鼠和大鼠体内的增强表达选择性地升高了血浆HDL胆固醇（HDL-C）水平。这项观察与人群研究结果一致，表明血浆ApoAⅠ浓度与HDL-C水平正相关，同时也提示可以采用升高血浆ApoAⅠ水平的措施来达到升高血浆HDL含量，从而改善血浆脂蛋白图谱特征（lipoprotein propile）的目的。

人类ApoAⅠ基因在小鼠体内的增强表达同时也改变了小鼠HDL的物理特性。野生型小鼠（Wildtype）的HDL颗粒通常显示均一性大小的特点。当表达了人类ApoAⅠ基因后，小鼠HDL颗粒分成大小二类，分别对应于人类血浆中的HDL₂和HDL₃颗粒尺寸。这说明ApoAⅠ本身能控制HDL的颗粒大小和分布，同时也解释了人类HDL颗粒大小的多态型。这种高效表达有人类ApoAⅠ基因的动物还被用来研究饮食和药物对HDL-C和ApoAⅠ水平的影响。实验结果显示许多食物和药物成分在大幅度改变血浆HDL-C和ApoAⅠ浓度时，不影响ApoAⅠmRNA水平。因而提示如下两点：（1）血浆ApoAⅠ的调控环节主要存在于转录后水平（posttranscriptional level），而不是转录水平；（2）在很大的生理甚至病理范围内，ApoAⅠ或HDL受体被饱和的可能性很小。在动脉粥样硬化的发病研究方面，ApoAⅠ基因的增强表达能减少动脉内泡沫细胞的形成和堆积。HDL能预防和对抗动脉粥样硬化发病的理论学说由此得到支持。

与ApoAⅠ基因的增强表达相对应，剔除（knockout）内源性ApoAⅠ基因的小鼠也研制成功。正如所料，这种小鼠由于没有表达ApoAⅠ基因，血浆HDLCh浓度极低。用普通饲料喂养这种缺乏ApoAⅠ基因的小鼠后，血浆总胆固醇和HDL-C均下降约75%左右。HDL所含胆固醇酯的流动性下降八倍，但组织内所含的游离和酯化的胆固醇含量正常，唯有肾上腺组织的胆固醇酯含量下降。有趣的是，组织学检查表明这种缺乏ApoAⅠ的小鼠，即使用高脂饲料喂养20周后，也不出现动脉粥样硬化的病理学变化，因而提示：虽然高浓度血浆ApoAⅠ和HDL能预防和对抗动脉粥样硬化的形成，低浓度血浆ApoAⅠ和低浓度HDL-C本身却不足以诱发动脉粥样硬化。

二、ApoAⅡ

ApoAⅡ在HDL中的含量仅次于ApoAⅠ，约占HDL总蛋白的20%。将人类ApoAⅡ基因在小鼠体内增强表达后，这种ApoAⅡ转基因小鼠的血浆HDL-C水平不受影响。这又与临床观察相一致，即血浆ApoAⅡ浓度与HDL-C含量无显著相关性。然而，这种小鼠的一部分HDL颗粒变小，且仅含有ApoAⅡ，不含ApoAⅠ；另一部分大小正常的HDL颗粒则含ApoAⅠ和AⅡ两者。这提示人类ApoAⅡ可能只影响HDL的颗粒大小而不影响HDL的血浆浓度。在动脉粥样硬化的发病方面，如果同时增强表达ApoAⅠ和AⅡ基因，ApoAⅠ本身的“保护防御“作用反被削弱，提示富含有ApoAⅡ的HDL颗粒不具有抗动脉粥样硬化的能力，也说明HDL的“防御动脉粥样硬化”功能只与ApoAⅠ有关。

三、ApoAⅣ

ApoAⅣ既可结合到HDL也能游离于血浆，主要由小肠合成，其功能尚不明确，推测可能与LCAT的激活、胆固醇逆向转运，以及小肠吸收脂质有关。将人类ApoAⅣ基因在小鼠体内增强表达后，血浆脂蛋白特征并无明显变化，餐后VLDL有升高趋势，小肠吸收甘油三酯、胆固醇、维生素A和E均正常，因而看不出ApoAⅣ有任何特定的生理功能。或许生理状态下的ApoAⅣ水平已足以发挥其作用。

四、ApoB

ApoB是乳糜微粒、VLDL、IDL和LDL的运载蛋白，人类肝脏合成的Apob 是一个完整的长度，分子量约520000道尔顿，称为ApoB₁₀₀，而小肠所合成的ApoB由于细胞内mNRA的“编辑加工”处理，其分泌出的ApoB分子仅为肝脏所分泌ApoB分子长度的48%，故称为ApoB₄₈。将人类ApoB基因整合到小鼠基因组内增强表达后，血浆ApoB水平上升，总胆固醇含量升高，这主要是由于LDL-C水平升高所致，LDL颗粒内所含甘油三酯的比例增大。尽管野生型小鼠血浆LDL水平远比人类血浆低，ApoB转基因小鼠的血浆LDL上升到相当于人类血浆LDL的浓度。

应用基因重组技术Homanics等首先于1993年剔除了小鼠内源性ApoB基因。这种Apob 缺乏的小鼠不仅表现出VLDL、IDL和LDL-C的下降，而且连HDL-C也降低。纯合子型Apob 缺乏的小鼠在胚胎发育期即死亡，杂合子型的死亡率也显著升高，神经管发育不全。能幸存的杂合子型ApoB缺乏小鼠出现雄性生殖机能下降。虽然HDL-C和血浆ApoAⅠ浓度低，肝组织内ApoAⅠmRNA水平并无异常变化，说明低水平ApoB状态能在翻译后水平影响和调节ApoAⅠ的生物合成。

五、ApoC

ApoC包括三个亚类：CⅠ、CⅡ和CⅢ，其中ApoCⅢ转基因小鼠最先被研制成功。ApoCⅢ主要结合于VLDL和HDL颗粒，其基因表达速率与血浆甘油三酯水平成正比。将人类ApoCⅢ基因在小鼠体内增强表达后，其血浆VLDL颗粒增大，富含甘油三酯，成为典型的人类原发性高甘油三酯血症动物膜型。这种动物血浆ApoCⅢ含量升高，ApoE含量相对下降，游离脂肪酸浓度也升高。动力学研究显示。ApoCⅢ转基因动物所发生的高甘油三酯血症主要是由于其VLDL清除障碍引起，而与ApoB的合成速度无关。从这类小鼠血浆分离出的VLDL对LDL对受体的亲和力下降。但对脂蛋白脂肪酶（LPL）的分解无影响。这项研究证明ApoCⅢ基因的增强表达能直接引起高甘油三酯血症，说明了ApoCⅢ在调节人类血浆甘油三酯水平过程中的重要作用。由于约有三分之一的中年人都表现有不同程度的高甘油三酯血症，而因其他基因异常所引起高甘油三酯血症的机率极小，因此，临床观察和控制ApoCⅢ水平应受到重视。

ApoCⅠ的功能目前尚不明确，已知ApoCⅡ是血浆LPL的生理激活因子。增强表达人类ApoCⅠ的转基因小鼠出现轻度高甘油三酯血症。出乎意料之外的是，增强表达人类ApoCⅡ基因后，小鼠也出现了高甘油三酯血症，其表现如同ApoCⅢ转基因小鼠。这种ApoCⅡ转基因小鼠表现有VLDL堆积，VLDL颗粒内ApoCⅡ比例增大，ApoE比例下降，VLDL清除障碍，而其合成无异常。由此看来，ApoCⅡ的功能远比人们所知道的要复杂。更令人费解的是，剔除ApoCⅡ基因而引起ApoCⅡ缺乏的动物也同样表现有高甘油三酯血症。

六、ApoE

ApoE是HDL和VLDL的蛋白成分之一。也是LDL受体和乳糜微粒残粒受体的结合蛋白。因而在血浆脂蛋白的清除过程中发挥重要作用。1992年由于Shimano等首先研制ApoE转基因小鼠，高效表达大鼠来源ApoE基因，导致血浆ApoE浓度高于正常倍4倍以上，其血浆VLDL和LDL-C含量显著下降。同位素示踪研究显示放射性VLDL和LDL颗粒的清除速度明显加快。不仅如此，这种高ApoE浓度的动物能对抗由高脂饲料诱导的高胆固醇血症。这说明高浓度ApoE能减少空腹状态下的致动脉粥样硬化性质的脂蛋白成分，并防止高脂饮食诱发异常脂蛋白血症。

ApoE基因剔除的小鼠模型也于1992年由Piedrahita等研制成功。与ApoB基因剔除后的表现不同，即使是纯合子型的ApoE基因缺乏，动物也能存活，生殖功能正常。当给这种ApoE缺乏的动物喂以普通饲料后。其血浆胆固醇水平可高达10.34-12.93mmol/L，这种胆固醇主要堆积于VLDL和IDL颗粒内。如果用西方型高脂饲料喂养这种ApoE缺乏小鼠，其血浆胆固醇可高达46.5mmol/L，也主要分布于VLDL和IDL部分。这些小鼠的甘油三酯无明显异常，提示存在有富含胆固醇的脂蛋白颗粒，类似于β-VLDL。动力学研究表明这种ApoE缺乏动物存在严重的脂蛋白清除障碍，完全证实了ApoE的受体结合功能。杂合子型的ApoE缺乏小鼠表现轻度降低的血浆ApoE水平，而其他脂蛋白水平正常，餐后脂血症时间轻度延长。由此可见，即使表达50%的ApoE基因也足以维持正常的脂蛋白代谢状态。

ApoE基因剔除的小鼠是动脉粥样硬化研究的良好模型。这种缺乏ApoE的纯合子型小鼠即使用普通饲料喂养，动脉壁亦出现明显的泡沫细胞沉着堆积。当用西方型高脂饲料喂养四周后，动脉粥样硬化斑块增大3倍以上，其病理特征、组织学分布等十分类似于人类动脉粥样硬化病变。其泡沫细胞内的脂质斑块富含有氧化型脂蛋白颗粒，血浆抗自身氧化型脂蛋白的自身抗体含量也明显升高。小鼠本是很不容易诱发动脉粥样硬化的动物种群，ApoE单个基因的变化能导致严重的高胆固醇血症和动脉粥样硬化，这显示ApoE在人类冠心病发病过程中扮演重要角色。

七、Apo（a）

Apo（a）是一种糖蛋白，以二硫键结合于LDL颗粒的ApoB分子上，野生型小鼠不表达Apo（a）基因，血浆也检测不出Apo（a）蛋白。将人类Apo（a）基因转送到小鼠体内增强表达后，小鼠血浆Apo（a）含量可高达9mg/dl，但不结合到小鼠的LDL颗粒上，而是以游离形式存在。此时如果注射人类LDL到小鼠血液系统，则上述所表达的Apo（a）与人源性LDL结合到一起。这说明人类Apo（a）只特异性与人类ApoB分子结合，也许是由于小鼠ApoB分子缺乏所对应的半胱氨酸残基的原因，尽管流行病学研究资料显示含Apo（a）脂蛋白（LP-（a））与冠心病有着不可分割的关系，增强表达了人类Apo（a）的小鼠并不出现动脉粥样硬化病变。由于人源性Apo（a）不结合到小鼠自身的LDL颗粒上，这项结果可提示Apo（a）本身并无致动脉粥样硬化的特性，或许这种特性是在Apo（a）结合到LDL后才获得并表现出来。

第二节　胆固醇酯转移蛋白基因表达的抑扬

CETP的功能是将HDL颗粒上的胆固醇转移到VLDL和IDL颗粒上，而将VLDL和IDL所含的甘油三酯反向转移到HDL。野生型小鼠缺乏CETP，若将CETP基因转置于小鼠体内增强表达后，小鼠血浆CETP水平可达到人血浆含量，结果导致HDL-C浓度下降，血浆ApoAⅠ降低，HDL颗粒变小等等。当CETP基因和ApoAⅠ基因二者同时增强表达时，CETP的影响更为突出，HDL-C下降幅度更大，HDL颗粒也更小，因此，CETP的作用似乎是降低HDL含量，缩小HDL颗粒尺寸等。

由于CETP所介导的脂质交依赖于HDL和VLDL分别作为供体和受体，因而有人将CETP，ApoCⅢ和ApoAⅠ三个基因同时在同一小鼠体内增强表达，这种CETP/ApoCⅢ/ApoAⅢ转基因小鼠表现出明显的高甘油三酯血症，如前所述，这是由于ApoCⅢ升高的结果。同时小鼠血浆HDL-C和ApoAⅠ水平非但没有因为ApoAⅠ基因的增强表达而上升，反而下降到极限，HDL颗粒也极小，这些指标复制了人类“高甘油三酯血症永远伴有低HDL-C”的表型，而这种表型在冠心病人群中最为普遍。因而提示有“ApoAⅠ+ApoCⅢ+CETP三种基因联合突变—异常脂蛋白血症—动脉粥样硬化”的因果关系。最近，猴子CETP基因被用于表达在小鼠体内，导致小鼠血浆CETP浓度的极剧上升。CETP活性与HDL-C及ApoAⅠ含量高度负相关。与HDL颗粒大小高度负相关，CETP活性与ApoB水平呈高度正相关。这些结果进一步证实CETP在脂蛋白代谢、胆固醇逆向转运和动脉粥样硬化过程中举足轻重。

第三节　参与脂类代谢有关酶蛋白基因表达的抑扬

一、脂蛋白脂肪酶

LPL的功能主要是催化水解VLDL颗粒和乳糜微粒内的甘油三酯。将人类LPL基因在小鼠体内高效表达后，脂肪组织内LPL活性升高7倍以上，血浆肝素后脂解活性升高二倍，而血浆甘油三酯水平降低75%，HDL₂-C则上升约2倍，动力学研究显示VLDL和餐后血浆脂质清除加快，这种小鼠能抵抗高脂饲料所诱导的高胆固醇血症。这些结果表明LPL的增强表达能影响血浆甘油三酯和胆固醇水平，并由此而抵抗动脉粥样硬化的发生和发展。

二、肝脂酶

人类肝脂酶基因已经被成功地转置于小鼠和家兔体内高效表达。利用腺病毒作载体将人HL基因种植于小鼠肝内后，HL活性比野生型小鼠高于100倍以上。即使在这样高活性状态，97%的HL仍结合于细胞膜表面的糖蛋白基因上。经肝素注射后被释放入血浆。HL缺乏的小鼠呈现空腹高胆固醇血症，HDL内磷脂成分增加，经过上述基因治疗手段高效表达人类HL基因8天后，血浆脂质回复正常状态，因而，HL基因治疗能克服因HL缺乏导致的症候群，促进HDL₂向HDL₃的转变过程。

当HL基因在家兔体内增强表达后，家兔血浆总胆固醇水平降低57%，HDL-C下降83%，其他脂蛋白所含胆固醇变化不大。与HDL下降一致的是，ApoAⅠ、ApoE以及ApoCⅢ的含量也下降。这种转基因家兔在饲以高脂饲料后，血浆胆固醇升高的幅度远没有野生型家兔明显，证明肝脂酶在血浆胆固醇平衡机制中起一定作用。

三、卵磷脂-胆固醇-酰基转移酶

人类LCAT基因在小鼠体内的增强表达能导致小鼠血浆LCAT活性升高2～100倍不等。低效表达（LCAT活性升高2倍左右）引起所有脂蛋白颗粒内的胆固醇酯含量上升20%～50%，但HDL颗粒大小无变化。高效表达（LCAT活性正常高出100倍以上）能导致血浆胆固醇酯含量高出正常2～3倍，HDL颗粒变大，并富含胆固醇脂和磷脂成分，ApoAⅠ和AⅡ的清除速度则相应变慢。

第四节　低密度脂蛋白受体基因表达的抑扬

一、低密度脂蛋白受体

LDL受体通过识别脂蛋白表面的ApoB和E而介导脂蛋白的清除。将人类LDL-R基因在小鼠体内增强表达后，标有同位素的LDL清除加快十倍以上，血浆ApoB和ApoE水平则下降90%。LDL的快速清除主要通过肝脏完成。当用高胆固醇饲料喂养这种动物后，血浆IDL和LDL不被诱导上升，仅仅VLDL的水平轻度升高。

近年来，LDL-R基因剔除的小鼠模型被研制成功。这种LDL-R缺乏的小鼠即使在普通饲料饲养条件下，血浆总胆固醇也高出正常2～3倍，而IDL和LDL含量则可上升8倍以上，IDL和VLDL-C浓度更明显剧增。这种LDL-R缺乏的动物被用来作基因治疗的对象，将装载有人类LDL-R基因的腺病毒载体注射到这种小鼠循环系统内，肝组织很快出现LDL-R的表达和活性。VLDL和LDL的清除速度随之加快，血浆IDL和VLDL含量明显降低。LDL-R基因剔除的小鼠被公认为是人类家族性高胆固醇血症的良好模型。

二、LDL受体相关蛋白

LRP可能是乳糜微粒残粒的相应受体。若将LRP基因剔除后，纯合子型动物不能生存，而杂合子型动物表现正常，因此，LRP在乳糜微粒残粒代谢中的作用尚不能肯定。

上述各个因素表达的变化对血脂及脂蛋白的主要影响效果概略归纳如下，见表14-1。由于在多数情况下这些变化对动脉粥样硬化的影响未有详细观察和报道，因此动脉粥样硬化发病的相应变化没有归纳于表14-1内。

表14－1　抑扬基因表达引起血脂及脂蛋白特征性变化一览表

（周明月）

（抑扬基因表达对脂蛋白代谢及动脉粥样硬化的影响）参考文献

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第十五章　血清脂类测定

血浆中的脂类包括胆固醇、胆固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。

目前，对有关脂类代谢疾患的诊断和治疗过程，均必须检测血浆（清）中的脂类，通过其含量的变化，对临床疾患提供协助诊断的依据。有关医学科研工作，脂类的定量检测也是一项必备的研究项目。

1．胆固醇测定

血浆中胆固醇及其酯的含量检测，从方法学上可分为两大类：一类是化学法包括抽提法和直接测定法，这类方法目前仍在沿用；另一类是酶法测定，方法敏感特异快速，并能自动化分析，已常规应用。化学测定法种类多，由于显色反应的特异性不同，其结果有一定的差异。目前公认的参考方法是Abell-Kendall(L-B反应)法。另外，三氯化铁-硫酸反应法（Zak法）具有显色稳定法、操作简便、灵敏度约5倍于L-B反应法，胆固醇酯与游离胆固醇显色程度比较接近等优点，缺点是特异性差，干扰因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清样品中的血红蛋白，胆红素以及硫酸的质量等因素均可影响Zak方法的准确性，Zak法更适合于科研使用。酶法测定血清胆固醇的方法已被广泛采用，国产试剂已能满足临床的需要。胆固醇测定用的标准品，按美国国家标准局（NBS）出品纯度达99.8%,是国际公认的参考物，国内李健斋等已纯化制成符合这一要求的胆固醇纯品，已供临床检测血清胆固醇使用。

2．甘油三酯测定

血浆甘油三酯的测定，目前多以化学法和酶法定量。化学法测定甘油三酯是以脂蛋白变性，水解成甘油，并以甘油为计算依据。酶法是以特异酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再测定甘油，方法特异，准确而快速，临床广为应用。目前甘油三酯测定的方法主要以定量甘油为依据，然而血清样品中存在有游离甘油，如何从反应过程中的总甘油中减去游离甘油，多年来一直在研究讨论这一问题。若不减去，其测定值将会高于血清样品中的真值，如果要减去，就必须先测出血清样品中的游离甘油，甘油三酯的测定方法将增加一个繁杂的步骤，实际工作中难以做到。有报道血清样品中的游离甘油实际量是0.07～0.13mmol/L，相当于甘油三酯的0.5～6.0mmol/L，为此建议，实测的甘油三酯量减去一个校正系数即：

甘油三酯（mmol/L）=[0.98×总甘油（mmol/L）]-0.07（mmol/L）。

这一校正系数也仅适用于健康人，对临床病人并不一定适用。据报道，血清样品的游离甘油一直是个未知数，无法测准。为此，目前临床测定血清甘油三酯时，基本上未考虑游离甘油，因为其含量很少，暂且忽略不记。甘油三酯测定的参考物，推荐三油酸甘油酯和三软脂酸甘油酯混合物（2：1，W/W），此参考物适用于化学法。在酶法测定中，仍以高纯度的三油酸甘油酯为参考物。

3．磷脂测定

血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神经磷脂、脑磷脂和其他少量磷脂。如需要分别检测各种磷脂，可以通过薄层层析法、柱层析法和高压液相色谱法。目前，临床仅测定血清磷脂总量。血清磷脂总量的测定方法有化学方法和酶法两大类。化学法是以磷脂中的磷为定量依据，因为每磷脂分子中都含有一个磷酸根，故将磷脂的磷称为脂性磷。由于血清中磷脂大部分为卵磷脂，其分子量中磷约占4%，故将脂性磷换算成磷脂的系数，一般为25。由于化学法均需要抽提，再测抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸盐不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸盐对磷脂测定的干扰很少。酶法是利用磷脂酶进行定量测定。生物体中磷脂酶包括磷脂酶A₁、A₂、C和D四种。磷脂酶D特异性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神经磷脂，三者约占血清总磷脂的95%，临床多用含磷脂酶d 的试剂进行磷脂的定量测定。

4．游离脂肪酸测定

游离脂肪酸属于未酯化的一类脂肪酸，故又称为非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必须是灵敏的方法，还需要避免脂肪水解产生脂肪酸的干扰。测定方法有：①滴定法需要微量滴定装置，因为要通过肉眼观察颜色，难免会有主观因素的影响，所以难以测定准确，很难用于常规；②光度法，以铜皂法常用；③酶法，主要采用特异性不强的脂肪酶D进行检测，方法特异，快速准确，已常规应用于临床。

第一节　胆固醇测定

血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，FC占30%。CE中的C₃的-OH在LCAT作用下，可分别结合亚油酸（43%）、油酸（24%）、软脂酸（10%）、亚麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

1．化学法

化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通过①～④步骤操作过程。常规操作中多采用省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以引用。

2．酵法测定

CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再经胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成△4胆甾烯酮和H₂O₂。再分别定量O₂的消耗或者H₂O₂的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量,以作为TC的定量依据。该法是目前常规的应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。

一、Abell-Kendall改良法

1．原理

血清加入醇溶性氢氧化钾，使胆固醇从脂蛋白中分离出来，同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇，加石油醚振摇、抽提，使胆固醇移入石油醚层，分离并取一定量的石油醚层，蒸发至干，再进行Liebermann-Burchard 显色反应，620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

2．试剂组成

*：在三角烧瓶内，加入无水醋酸，于冰水中冷至10℃以下，再慢慢加入浓硫酸，混合，静置10min，又加冰醋酸混匀，备用。

3．操作

图15-1 血清胆固醇（Abell法）测定操作图

按图15-1操作。

4．计算

标准总胆固醇浓度=E_SA/E_ST×5.17(mmol/L)

二、酶法（CEH、COD-POD法）

首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶（CEH）水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶（COD）作用下，生成△4-胆甾烯酮和H₂O₂，再H₂O₂经过氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）参与下，生成红色醌亚胺色素。

H₂O₂+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

（一）手工测定法

1．试剂组成

*混匀，调pH至6.70±0.10(25℃)，或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

2．操作

按图15-2操作。

3．计算

标准总胆固醇浓度=E_SA/E_ST×5.17(mmol/L)

（二）自动化分析仪测定

以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

1．试剂组成

A液：CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

B液：COD、4-氨基安替比林等。

图15-2 血清胆固醇测定（酶法）操作图

2．上机参数

3．操作过程

4．计算

以△A=A2-A1，根据同样处理之标准或质控物计算，打印结果。

5．注意事项

（1）试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

（2）试剂在有效内2～8℃避光食保存。

（3）胆固醇含量超过200mmol/L，需用生理盐水稀释再测。

第二节　甘油三酯测定

甘油三酯又称中性脂肪，由于其甘油骨架上分别结合了3分子脂肪酸、2分子脂肪酸或1分子脂肪酸，相应称为甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）和甘油一酯（MG）。血清中90%～95%是TG，TG中结合的脂肪酸分别为油酸（44%）、软脂酸（26%）、亚油酸（16%）和棕榈油酸（7%）。

血清TG测定方法一般分为物理化学法、化学法及酶法三大类。

血清中TG的化学组成并不单一，准确求其分子较为困难。因标准不同，测定结果存在差异。化学法多采用三棕榈精（软脂精）（分子量807.3）、三油精（分子量895.4）为标准，按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。

1．化学法

化学测定法包括：①TG的抽提分离；②皂化；③甘油糖的氧化；④氧化生成甲掌显色定量等四个阶段。操作较为繁杂，影响测定因素太多，本法准确性差，一般很少用。

2．酶法测定

酶法测定包括：①TG的抽提与皂化；②加水分解生成甘油糖定量等二个阶段。目前常规检测应用的方法有甘油激酶（glycerolkinase,GK）法和甘油氧化酶（glycerol Oxidase,GOD）法。操作简便，快速准确，并能在自动化生化分析仪上进行批量测定。

一、乙酰丙酮法

1．原理

血清中加入异丙醇抽提取甘油三酯，经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸，甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛，在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色的3，5二乙酰，1，4二氢甲基吡啶，其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比，420nm测定定量。该法可用于基本功训练及组织细胞TG的提取测定。

2．试剂组成

3．操作

按图15-3操作。

图15-3 血清甘油三酯（乙酯丙酮法）测定操作图

4．计算

血清TG浓度=E_SA/E_ST×1.13(mmol/L)

二、酶法（GK-GPO-POD比色法）

血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成H₂O₂，H₂O₂与底物4-氨基安替比林和ESPAS在过氧化物酶（POD）作用下，生成红色亚醌化合物（quinoneimine），比色（500nm），其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。

（一）手工测定法

1．试剂组成

*：一般采用商品试剂盒

图15-4 血清甘油三酯测定法（酶法）操作图

2．操作

按图15-4操作。

3．计算

血清TG浓度=E_SA/E_ST×2.26(mmol/L)

（二）生化分析仪检测

全自动生化分析仪测定操作（以CL-7200型为例）。

1．试剂

A液：GK，GPO，4-AA-P、抗坏血酸氧化酶等。

B液：POD，Lipase,ESPAS等。

标准液：甘油三油酸酯 200mg/dl(2.26mmol/L)。

2．上机参数

3．操作过程

4．计算

以△A=A2-A1并根据同样之标准或质控物计算，自动打印结果。

5．注意事项

①试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

②试剂在有效期内2～8℃避光保存。

③样本中甘油三酯含量超过11mmol/L需用生理盐水稀释后再测。

第三节　磷脂测定

磷脂（PL）并非单一的化合物，其分子内含有磷酸基的多种脂质，磷脂是这一类物质的总称。血中PL包括：①卵磷脂占60%和溶血卵磷脂占2%～10%；②磷脂酰乙醇胺等，占2%；③鞘磷脂，占20%。

血清PL定量方法包括测定无机磷的化学法和酶法两大类。

1．化学测定法过程包括：①抽提分离；②灰化；③显色、比色的三个阶段。

2．酶测定法

可分别利用磷脂酶A、B、C、D等4种酶作用，加水分解，测定其产物，对PL进行定量。一般多采用磷脂酶D（PL-D）进行定量。PL-D可作用于含有卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂以及含胆碱的磷脂，这三种磷脂约占血清总磷脂的95%。本法快速准确，便于自动生化分析仪器进行批量检测。

一、化学法（消化法）

1．原理

以有机混合试剂（无水乙醇、乙醇）抽提血清中磷脂，再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物，用硝酸盐与磷反应生成有色化合物，比色定量。本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。

2．试剂组成

3．操作

按图15-5操作。

4．计算

血清脂性磷浓度=E_SA/E_ST×10(mg/dl)

血清磷脂（以卵磷脂计）=E_SA/E_ST×10×0.3229(mmol/L)

图15-5 血清磷脂测定（消化法）操作图*采用带塞玻璃试管

二、酶法

1．原理

磷脂酶D因特异性不高，能水解血清中卵磷脂，溶血卵磷脂和神经磷脂（三者占血清总磷脂的95%），释放出胆碱，胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H₂O₂，在过氧化物酶作用下，H₂O₂，4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物，其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比，在500nm波长下比色计算结果为：

2．试剂

（1）酶应用液（参考配方）：每100mlTris-His缓冲液（50mmol/L，pH7.8）中含：

(2)标准液：纯卵磷脂，临用前配制，5mg/2.5ml蒸馏水（含TritonX-1000.5%）

3．操作

（1）标本采集：空腹12h抽静脉血，不抗凝，分离血清或抗凝血分离血浆。

（2）在3.0ml酶应用液中加入血清（浆）20μl，标准管加标准液20μl，空白管加水20μl，放置37℃水浴10min后，波长500nm，比色，空白管液调零。

4．计算

血清磷脂（mg/dl）=TA/SA×200

血清磷脂（mmol/L）=血清磷脂（mg/dl）×0.01292

第四节　非酯化脂肪酸测定

临床上将C₁₀以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W⁹）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W^{6，9，12，15}）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。

1．非酶法测定

非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。

2．酶测定法

主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。

图15-6 血清主要FFA酶法测定图

□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶；　PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。

一、亮度法

1．原理

血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。

2．试剂组成

3．操作

按图15-7操作。

4．计算

血清游离脂肪酸（μmol/L）=E_SA/E_ST×500

二、酶法

1．原理

血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。

2．试剂组成

*应用带玻塞离心管

3．操作

按图15-8操作。

4．计算

图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

图15-8 血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图

（胡汉宁　储建中）

（血清脂类测定）参考文献

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第十六章　血浆脂蛋白的分离纯化及定量

第一节　脂蛋白分离的方法学评价

血浆脂蛋白和脂质测定是临床生化检验的常规测定项目，其临床意义主要是：①早期发现与诊断高脂蛋白血症；②协助诊断动脉粥样硬化症；③评价动脉粥样硬化疾患如冠心病脑梗塞等危险度；④监测评价饮食与药物治疗效果。

血浆脂蛋白测定分离的常用方法有超速离心法、沉淀分离法、电泳分离法及免疫分离法。根据脂蛋白分离纯化或定性定量等不同的需要可以选择不同的方法，如图16-1所示。

图16-1 人血清脂蛋白的电泳和超速离心分离相应位置模式及名称比较图

一、超速离心法

超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白比重（密度）的差异，在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。

血浆在不同密度盐溶液中经过超速离心，各种脂蛋白按密度大小漂浮于不同盐溶液介质中。脂蛋白漂浮的恒量单位是漂浮率（Sf），Gofman等于1950年确定，血浆脂蛋白在比重为1.063的NaCl溶液中（26℃），每秒每达因克离心力的作用下的漂浮速度，称为1个Svedberg单位（10^-13S_f）。S_f越大，脂蛋白密度越低。

一般操作方法是将血浆置于已准备好的不同密度梯度的盐溶媒介质中，在强大离心力作用下，各脂蛋白依其自身在不同分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层媒层，达到分离纯化的目的。

越速离心法是分离纯脂蛋白的有效技术，目前广泛应用于脂蛋白载脂蛋白代谢的研究中。

二、电泳分离法

不同脂蛋白因蛋白质含量不同，其荷电量不同，故可用电泳方法进行分离，并根据血浆脂蛋白的电泳迁移率不同予以判断、确认。电泳支持物一般常用醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。由于醋酸纤维薄膜要予处理，很繁杂，外加电泳时间过长，目前已很少使用。临床检验中主要采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，快而较为准确，仪器设备要求不高，被广泛采用。聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，分离脂蛋白，分离率高又准确，值得推荐给临床使用。

电泳分离法，不论用何种支持物，血浆脂蛋白需用亲脂染料如苏丹黑B等进行预染再电泳，电泳完毕，脂蛋白根据荷电量不同，其适移率不同，再置于光密度下进行扫描，计算出各种脂蛋白百分比，该数值乘以血浆总脂量，即可求出α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白含量。乳糜微粒停留在原点，无法测出其含量，正人空腹12h后，血浆中无CM存在。也可将电泳完毕的琼脂糖凝胶中的脂蛋白区带切割置于试管中，加水溶解，进行比色，测出各自百分比，但因其是手工半定量法，难以测准，属淘汰之列。

三、沉淀分离法

由于脂蛋白的组成及理化性质不同，在不同的聚阴离子和2价不同金属离子（Mn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Co²⁺）以及不同pH值条件下，使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离定量各种脂蛋白的目的，如以肝素锰沉淀剂先沉淀血清中VLDL和LDL，离心，HDL在上清液里，再定量HDL量，即为血浆HDL的量。采用聚乙烯硫酸盐沉淀LDL，测定血浆的LDL量。

脂蛋白是一种既有蛋白质，又有胆固醇，还有磷脂的复合体，如何定量，目前尚无理想的方法。现在以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据。即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C）。这类测定方法是目前临床广泛使用的快速并较为准确的方法。

第二节　血浆脂蛋白超速离心分离纯化法

一、超速离心法简介

为了研究，常需要得到脂蛋白纯品并进一步分离纯化载脂蛋白，迄至目前为止，采用密度梯度超速离心分离纯化各种脂蛋白仍是一种很好的方法。

超速离心法可分为制备型和分析型两种，根据其所用介质密度不同，可以分为等密度离心，密度梯度离心等。根据所用转头的类型不同可以分为角头、甩平头、垂直头和区带头离心法。脂蛋白分离中，采用密度梯度超速离心法较多。

离心作用是根据稳定角速度下做圆周运动的任何物质都受到一个外向的离心力F，这种力的大小取决于角速度（以弧度ω表示）和旋转半径r（以cm计算）。

F=ω²r

F常用地球引力表示，称为相对离心力（RCF）或者常用“数字×g”来表示。

RCF=ω²r/980

在使用该公式时，这些关系需用“每min转数（r/min）”表示，这是表示离心机转动速度的普通方式。

由于（r/min）的数值可转换成弧度，利用ω=π（r/min）/30公式代入上式，得到下述换算式：

RCF-（πr/min）²×r/30²/980=（1.119×10^-5）（r/min）²·r

对于在离心转头中旋转的样品，估计其所受到的相对离心力需要考虑样品到旋转中心的固定距离（r）。由于转头的形状设计，离心管中从管顶主管底各点旋转中心的距离是不同的。例如在固定的角式转头中，作用于离心管顶部和底部的离心力的差别接近一倍。为了计算相对离心力的数值可用平均相对离心力（RCF_平均）来表示，即同一离心转头顶部和底部所受离心力的平均值。因此，最重要的将是确定半径（r）的数值。

形成密度梯度操作，可采用两种方法，一是利用自动形成器，此装置是在一根管道上装有两个容器，各以T型管与此管道相通，两容器分别装入轻液和重液，按比例进入混合器，并用蠕动泵将溶液注入超离心管内，形成不同密度液，加入到超离心管中，使其离心管中液体成密度梯度离心分布。二是采用手工操作，先配成不同密度溶液，人工一层层铺盖到超离心管内，使超离心管中成为不同密度梯度的溶夜。

超速离心后样品的收集可根据不同的实验条件采用下述几种方法。

（1）切割法：在固定的刀架上，将已离心好的样品管放在所要求的高度（按管内分离区带确定）用刀切断离心管，取出样品。

（2）虹吸法：用蠕动泵或吸管将样品从上至下逐层按区带吸出并分管收集。泵管或吸管注意每区带一管，不能混用。

（3）穿剌法：用针头在超速离心管底部穿一小孔，让液体从底部流出，并按区带分部收集。

分管收集到的各区带样品，可采用折光仪，测出折光系数，从表中查出相应溶液的水合密度，从而确认各组份的分布样品的水合密度。

二、Hatch-Lee法（同时分离血浆脂蛋白方法）

1．试剂

0.5mol/LEDTA（pH8.0）:186g EDTA-Na₂加入去离水950ml，用NaOH调准pH值，再加水到1L。

溶液①（d=1.006）:NaCl 11.40g,0.5ml0.5mol/L EDTA液，加去离子水1l，EDTA可抑制脂蛋白中脂质的氧化。

溶液②（d=1.182）:NaBr24.98g溶于溶液①100ml中。

溶液③（d=1.478）:NaBr78.32溶于溶液②100ml中。

0.15mol/LNaCl,0.3mlEDTA:8.77g NaCl、0.6ml的0.5mol/l EDTA（pH8.0），再加双蒸水到1L。

d=1.019液：1.851gKBr溶于溶液①100ml中。

d=1.063液：8.343gKBr溶于溶液①100ml中。

d=1.215液：33.496gKBr溶于溶液①100ml中。

以上溶液的密度，必要时用折射仪检测。

2．操作

取10mlEDTA Na₂抗凝（1mg/ml）采血，离心（3000r/min）10min，分离得血浆。取血浆4ml加入容量10ml的超离心管中的底层，上面铺盖2ml溶液①(d=1.006)液，20kr/min(26kXg)离心30min(4℃)，不用制动器让其旋转减速，以防飘浮物与下浮层相混；取出下层4ml混合血浆待用；超离心管中残留2ml，再取溶液①2ml沿管壁加入，仔细混匀分散脂蛋白，又加溶液①2ml铺在表面，20kr/min，4℃，离心1h，取出上层液直至变界处，此即CM组份。再将第一次离心所得的下层4ml混合血浆取出，其上铺2ml溶液①，40kr/min（100k×g），18℃离心17h，取上层1ml液，此即VLDL组份。再取出1ml至交界处，弃去，将管内剩余的4ml混合液移入另一超离心管内，取2ml溶液②（d=1.182）洗出离心管中残余的脂蛋白，加入到装4ml混合液超离心管内，混匀，40kr/min，18℃，离心21h，取出上层（d=1.062）1ml混合液，此即LDL组份。继续将中间层1ml除去，残存的4ml转入到另一超离心管内，用d=1.478（溶液③）2ml洗涤原管，尔后移入4ml残存液管内，仔细混匀，40kr/min，18℃，离心41h，上层（d=1.20）部分吸出，即HDL组份。下层为VHDL（very high density Lipoprotein）与其他血浆脂蛋白。LDL与HDL分别对0.15mol/lNaCl-0.3mmol/L EDTA(pH8.0)透析，4℃保存。

三、从血浆直接分离LDL

用EDTA抗凝血，离心得血浆，可采用大容量（300ml）超离管进行。血浆容量依次要加定量的KBr（Xg），可按下述公式计算：

V为血浆容量（ml）数，d₁、d₂分别为该配制的最初的两种溶液密度，υ为调节密度用的KBr的目的试剂水密度的偏比容。血浆d=1.006。首先调节溶液密度到d₂=1.019，离心除去。VLDL，d₂=1.019的υ为0.2922，即1ml血浆中应当加KBr0.01851g，溶解后，每管注入约16ml将d=1.019溶液8ml（0.5体积）覆盖其上，40kr/min，18℃，离心16h，再除去黄色层以上的上层界面液，测量下层黄色层液ml数，再按上式计算添加0.0644g/mlKBr，以成d=1.063的溶液（υ=0.2982）同样每管（16ml）加8ml的d=1.063溶液覆盖其上，40kr/min，18℃，离心16h，取上层黄色区带，并对0.15mol/lNaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0)充分透析，该黄色脂蛋白即LDL，可用作LDL受体的配体。

添加KBr量计算式中的偏比溶（υ），d=1.019、1.063、1.125、1.210、1.215的值相应为0.2922、0.2982、0.3035、0.3090、0.3093。

四、硫酸右旋糖苷（DS）沉淀血清脂蛋白法

1．试剂

1%DS、10%DS、2mol/L CaCl₂、1mol/L K₂C₂O₄、12%NaCl、0.2mol/l Tris-HCl、0.9%NaCl、0.01mol/L EDTA(pH7.4)

2.操作

混合血清在3000r/min下，离心30min，除去血细胞及其他固体物质，再以2000r/min离心30min（4℃），以除去血清中的CM。

取一定体积的上述血清，加1%DS，使血清中的DS浓度为0.05%，加2mol/lCaCl₂，使血清中CaCl₂的终浓度为0.1mol/L，搅拌后放4℃冰箱过夜，于第二天离心（3750r/min）30min，将离心后的沉淀物溶解在12%NaCl中，而后加0.2mol/l Tris-HCl缓冲液250ml（pH7.4），离心10min,弃去上清，将所得沉淀用0.02mol/l Tris-HCl再洗一次，此步骤要重复3次。将最后得到的VLDL和LDL溶解在7.5～15ml的1mol/L草酸钾中（4℃），3750r/min离心30分钟，去掉沉淀，然后将此溶液在1%NaCl，1%BaCl₂溶液中透析48h（4℃）。将透析过的溶液放于离心管中去掉沉淀。把上清液再放入0.02mol/l Tris-HCl缓冲液透析72h，离心，其上清则含有较纯的VLDL和LDL

五、无脂蛋白血清的制备

1．用途：无脂蛋白血清（lipoprotein deficient serum,LPDS）主要用于LDL受体活性测定的细胞培养。

2．操作：常规采血，室温放置1～2h，以3kr/min离心10min，分离得到血清。向血清中按每1ml加0.33496g KBr，使其血清密度为d=1.215，或者按等体积加d=1.215的KBr液，按前述两方法铺在血清上面，按40kr/min(100k×g)速度，离心40h。离心完毕，将淡黄色上层脂蛋白与无色的中间层除去，下层液上再铺d=1.215溶液，重复上述离心操作。将下层液，对0.15mol/l NaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液透析，用过滤器除菌，尔后分成小包装贮存在-20℃备用。

六、其他方法

除上述介绍的常用方法外，还有凝胶过滤和高压液相层析法分离血浆脂蛋白的方法，有关参考书很多，在此不一一介绍。

第三节　血浆脂蛋白电泳分离定量法

一、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

（一）原理

以聚丙烯酰胺为支持介质，血清脂质用染料预染，使脂蛋白着色，经电泳后，一般可分出三条区带，即β-、前β-、α-脂蛋白。并可用光密度扫描仪检测其相对百分数，乘以总脂量，可求出三种脂蛋白的含量。

（二）试剂与仪器

1．试剂

（1）分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷（Tris）18.3g,lmol/L盐酸24ml，加水至100ml(pH8.9)。

（2）丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4g，混匀。

（3）0.35%过硫酸铵（AP）

（4）四甲基乙二胺（TEMED）

（5）丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g、加水至100ml，混匀。

（6）浓缩胶缓冲液：Tris 6g、1mol/L HCl。

（7）0.002%核黄素，48ml，加水至100ml，pH6.7。

（8）电极缓冲液：甘氨酸2.88g、Tris0.6g、加水至1000ml，pH8.3。

（9）1%苏丹黑B染色液：苏丹黑B200mg，丙二醇20ml，水浴加温至溶，离心，去除沉渣，冰箱保存备用。

（10）40%蔗糖水溶液。

2．仪器

电泳仪、光密度扫描仪

（三）操作

1．制胶

（1）先准备清洁的0.5×7.5cm玻璃管，封口底。

（2）配制5%浓度凝胶：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml，分离胶缓冲液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED，20μl，混均，用吸管注入每支玻璃管内使胶柱长约4cm，上层用蒸馏水沿管壁仔细加水到凝胶表面，千万别冲散凝胶界面，使凝胶与空气隔绝。静置20～40min，等凝胶凝固后，除去上层水，再加上浓缩胶。

（3）浓缩胶制备：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、浓缩胶缓冲液0.5ml、核黄素液0.5ml和水2ml混匀，加TEMED20μl混匀，迅速加入到分离胶上层约1cm高度，沿管壁仔细加蒸馏水覆盖，千万别冲散凝胶界面。置日光灯处聚合30min，也可在强光下聚合，聚合好的浓缩胶呈淡乳白色。凝胶可置4℃冰箱备用。

2．血清预染与加样

在0.25ml血清中加入1%苏丹黑B染色液0.025ml，摇匀，于37℃水溶保温45min。离心除去沉渣，取预染血清30μl，加在聚合好的倾去水层的浓缩胶表面，再加一滴40%蔗糖液，混匀，然后小心地在上面加满电极缓冲液，再装在电泳槽上。

3．电泳

将电极液加入上下电泳槽内，靠样品端的上槽接负极，下槽为正极，接通电源，调节电流为2-5mA/管，30～40min后，关闭电源。

4．剥胶

从电泳槽上取下凝胶管，用带长针头的注射器吸水注入凝胶与玻管内壁之间，使凝胶与玻管内壁分离，再用吸耳球推出凝胶。根据不同型号的光密扫描仪，凝胶扫描或者将装有凝胶的玻管直接扫描定量。

电泳后凝胶一般出现三条区带，从正极到负极依次为α-脂蛋白，β-脂蛋白和前β-脂蛋白，前β-脂蛋白处于浓缩胶和分离胶之间。

5．定量

浆凝胶或连同玻管一道置于光密度计扫描仪上进行扫描，计算每个峰的面积占各峰之和和总面积之比，即为每种脂蛋白组份的百分比。

二、血清脂蛋白琼脂糖电泳法

（一）原理

以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预染，使血清脂蛋白着色，然后电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解，冷却后比色。或者用光密度计直接扫描仪定各区带。计算出α、β-和前β-脂蛋白的相对百分比。

（二）试剂

1．巴比妥HCl缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）：称取巴比妥钠15.5g，加入1mol/LHCl12ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，此为电极缓冲液。

2．巴比妥-HCl缓冲液（pH8.6,离子强度0.05）：称取巴比妥钠10.3g,加入1mol/LHCI8ml，混匀溶解，加蒸馏水至1000ml，用于配琼脂糖凝胶用。

3．0.8%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.8g，溶于配琼脂糖凝胶的缓冲液100ml，置沸水煮溶或置于微波炉中热溶解。

4．1%苏丹黑B的石油醚-乙醇（1：4，V/V）溶液。

（三）操作

1．预染血清：吸血清0.2ml于一小试管中，再加苏丹黑B染色液0.02ml及无水乙醇0.01ml。混匀后置于37℃水溶预染20min。取出各管，2000r/min离心5min，以除去多余的染料。

2．琼脂糖凝胶板制备：将0.8%琼脂糖凝胶溶解后，吸2.5ml到载玻片上，趁热将刻点样槽用有机玻璃盖放在距载玻片一侧近1cm处。一块载玻片前后可打两个槽点两份样品。

3．点样与电泳：取下凝胶上有机玻璃盖并显出一加样小槽。取预染血清40μl，注入此小槽中。在电泳槽内加入巴比妥电极缓冲液，样品端为负极。以四层滤纸或沙布搭桥按10V/cm电泳，待预染血清电泳至最高或40min，切断电源。

4．定量：

（1）切割比色法：将凝胶板上各脂蛋色带分别切开置于装入有3ml蒸馏水的试管内。切相应大小的空白琼脂糖放入3ml蒸馏水试管内，为空白管，各管放入沸水煮3min，琼脂糖溶解，待冷，以空白管调零点，于660nm处比色，记录吸光度，以α-、前β-和β-脂蛋白三条区带吸光度总和，比各自区带的吸光度，求其百分比。这种半定量方法不够准确，误差很大。

（2）扫描定量：预染脂蛋白琼脂糖凝胶电泳毕，其琼脂糖凝胶板上有色带，可直接置于光密度扫描仪扫描，并得出各区带的百分比，如果输入该病人的血脂总量，即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量，如图16-2所示。

图16-2 血清脂蛋白电泳（琼脂糖）

正常参考值（百分比）：

α-脂蛋白 25.7±4.1%

前β-脂蛋白 21.0±4.4%

β-脂蛋白 53.3±5.3%

注意事项：①血清样品要新鲜；②为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清。

第四节　血清脂蛋白非电泳定量法

一、高密度脂蛋白胆固醇测定

血浆中脂蛋白有多种，测定其各自的含量对于了解机体正常及疾病过程中脂质代谢状况有重要的临床意义。HDL是一组不均一的脂蛋白颗粒，其胆固醇含量占血浆总胆固醇量的25%～35%。由于血浆中所有脂蛋白均含有胆固醇，因此，只有先分离出HDL才能对其进行定量。分离HDL的方法中，沉淀法是目前临床使用最多的方法，操作简便快速。沉淀法原理是利用多聚阴离子和二价阳离子共同作用于脂蛋白，并选择性地使含ApoB的VLDL和LDL脂蛋白沉淀，再测定含HDL的上清液胆固醇，即高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。定量HDL全量是很困难的，因为它是蛋白质和脂类的混合物，故以测定HDL中所含胆固醇含量作为HDL定量依据。

要测定血清中HDL-C，就必需先沉淀HDL以外的脂蛋白，即VLDL和LDL。使血清中VLDL和LDL沉淀的试剂很多，常用的有四种：①肝素-锰沉淀法，该法操作简便易行，一旦遇上血脂升高的标本，有沉淀不完全的差异；②硫酸葡聚糖-镁法，该法也简单易行，试剂较贵而难买到；③聚乙二醇法，虽然简便易行，若遇高脂血症标本，其重复性差；④磷钼钨酸-镁法，操作简便易行，结果准确，是目前临床推荐使用的方法；⑤另有一种不沉淀VLDL和LDL也可直接测定HDL的方法，称之为直接测定法。其原理是，先用一种封阻血清VLDL和LDL，而不封阻HDL，当测胆固醇的酶试剂加入后，酶可作用于HDL的胆固醇进行化学反应，测出其浓度，但酶试剂就无法使已被试剂封阻的VLDL和LDL的胆固醇进行反应，这种直接法操作更为简便，无需离心等繁杂步骤，便于在自动生化分析仪上进行HDL-C测定，结果准确可靠，缺点是成本过高。下面仅介绍目前推荐使用的方法。

（一）原理

磷钨酸-镁（PTA-Mg²⁺）沉淀血清中含ApoB的脂蛋白（VLDL、LDL），上清液中只含HDL，用酶法测定上清液中胆固醇，即HDL-C。

生成的醌亚胺与HDL中的CE及FC成正比。

2．试剂组成

（1）沉淀剂磷钨酸钠4g溶于50ml双蒸水中，加入1mol/l NaoH16ml，充分搅拌后，再加双水至100ml，调pH到7.6。再取40ml此溶液，加2mol/l MgCl₂10ml，混匀，再加水至100ml，此为应用液。

（2）胆固醇酶法测定试剂（同第十五章）

（3）胆固醇标准参考液（同第十五章）

3．操作

（1）空腹12h，抽取静脉血，不抗凝，分离血清备测。于24h内操作完毕。

（2）其他操作同前。

4．注意事项

（1）室温以15～20℃为宜，＜15℃或＞30℃时应增加或减少静置时间，离心转速要恒定一致。

（2）离心沉淀后，要立即吸出上清进行测定，否则结果偏离不准。

（3）若血清TC超过500mg/dl时，上清液会出现混浊，表明有部分胆蛋白漂浮在上清液中未沉淀完全，此时将血清稀释重新沉淀，其所测值乘以稀释倍数。

（二）血清HDL-C选择遮敝直接测定法。

1．原理

含反应抑制剂的阴离子表面活性剂加入血清中后，与CM、VLDL和LDL紧密结合，少量与HDL结合。尔后，再加入反应促进剂的聚阴离子表面活性剂后，HDL溶化并释放出胆固醇，与胆固醇测定试剂进行反应，达到仅测出高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）的目的，其反应全过程为：

2．试剂（第一化学）

RⅠ：前处理液（第一反应液）

RⅡ：第二反应液（可溶性表面活性剂）及显色液

HDL-C参考血清

3．操作

按双试剂双波长法在CL-7200型全自动生化分析仪进行检测，有关参数如表16-1所示。

表16-1 HDL-C检测参数

标本浓度按△A=A₂-A₁的吸光度计算

4．特点

（1）直接测定，无需预处理。

（2）操作简便，减少影响准确性的因素。

（3）标本及试剂用量少，准确性高。

（4）抗干扰能力强，适合于自动化分析。

（5）该法CV为5%以下，回收率90%～110%。线性范围（0～5.85mmol/L）。

5．注意事项

（1）待测血清标本于当日测试，2～8℃保存，一周内测定，-20℃长期保存，对测定结果无影响。

（2）干扰物维生素C500mg/L、胆红素200mg/L、Hb5.0g/L以下均不影响测定结果。

二、血清低密度脂蛋白测定

LDL是一组不均一的脂蛋白颗粒，其胆固醇含量约占总胆固醇的45%～50%。

测定血浆中LDL，首先同样要分离LDL，其分离方法有超速离心法、聚阴离子沉淀法、色谱法、电泳法及计算法等。以聚阴离子沉淀法简便易于操作，结果准确可靠。由于直接测定LDL有一定的困难，因为它是蛋白质脂类组成的颗状结构，胆固醇是其较为衡定的因素，因此采用测定LDL中所含的胆固醇的浓度作为LDL定量的依据。

另外，还可以通过用Friedwal公式计算，主要是利用血清TC、TG及HDL-C浓度测定结果，即LDL-C=TC-HDL-C-（1/5）TG。对脂代谢异常的高脂血症，不能按此方法计算结果。

（一）聚乙烯硫酸盐（PVS）法

1．原理

生成的醌亚胺与上清液的TC含量成正比。

2．试剂组成

（1）沉淀剂：聚乙烯硫酸钾盐0.7g/L、聚乙二醇独甲醚170g/L、乙二胺四乙酸5mmol/L，混匀，4～21℃避光可保存一年。

（2）酶法胆固醇测定试剂（同第15章）。

（3）胆固醇标准液：2.58mmol/L。

3．操作

（1）空腹12h，采静脉血，3h内分离完成血清以免脂蛋白之间相互交换和防止LDL降解。-70℃可以保存数月之久。

（2）取200μl血清置于含有沉淀剂100μl试管中充分混匀，室温放置15min,3000r/min离心，留上清测定胆固醇。

（3）按下表进行操作：

混匀，37℃6min，以空白管调零（500nm），读取光密度。

（4）计算

血清LDL-C=TC-上清液胆固醇

（5）注意事项

标本沉淀过程严格按要求进行。吸取上清液时，注意轻吸，别搅动沉淀。

PVS法能将Lp（α）完全沉淀，一般情况下，正常人含量极少，一旦高脂血症、Lp（α）增高时，其测定值LDL-C应为LDL-C和Lp（α）-C之和。

（二）血清LDL-C直接测定法

1．原理

含反应活性剂的试剂Ⅰ加入血清后，与HDL、VLDL和CM反应，使其胆固醇水解并与酶反应生成无色产物溶于介质中。再加入含溶解LDL的活性剂Ⅱ试剂，使LDL水解并与其中的胆固醇试剂进行偶联反应生成红色化合物，定量血清中LDL-C。

以△A=A₂-A₁进行运算，测出LDL-C的含量

2．试剂（第一化学）

R1：去垢剂1、COD、POD、4-AAP。

R2：去垢剂2、DSBmT。

3．操作

按CL-7200型或其他型号全自动生化分析仪检测，有关参数如表16-2所示。

表16-2　LDL-C检测参数

4．特点

（1）直接测定，无需预先处理。

（2）操作简便，减少影响准确性的因素。

（3）标本及试剂用量少，准确性高。

（4）抗干扰能力强，适合于自动化分析。

（5）该法CV为5%以下，回收率90%～110%，线性范围0～88mmol/L。

5．注意事项

待测血清标本于当日测试，2～8℃一周内保存，-20℃以下长期保存，结果均不受影响。

三、高密度脂蛋白亚组份胆固醇（HDL2-C，HDL3-C）检测

聚乙二醇20000沉淀法

1．原理：

HDL中主要组份为HDL₂和HDL₃。用聚乙二醇20000（PEG20000）作沉淀剂，以不同浓度在不同pH条件下，可将HDL₂和HDL₃分离开。95g/L聚乙二醇20000在pH6.5环境下可将血清中低密度脂蛋白（LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）沉淀，离心后上清液中只含HDL。170g/L聚乙二醇20000在pH7.5环境中，可将LDL、VLDL、HDL₂沉淀，离心后上清液中只含HDL₃，以酶试剂侧定各自上清液中胆固醇含量，通过换算，计算出代表HDL各亚组分含量。

2．试剂：沉淀剂Ⅰ：95g/L PEG20000，pH6.5

沉淀剂Ⅱ：170g/LPEG20000，pH7.5。

胆固醇酶应用液及参考血清以试剂盒而定。

3．操作方法：（以生化分析仪为例）按表16-3操作

表16-3 HDL-C亚组分测定操作步骤

置混匀器上混匀2min，置室温10min，3000r/min离心20min，上清液待测。

上清液于生化分析仪测定，测定参数参照总固醇测定法。

5．结果计算

HDL-C=上机测得结果×血清稀释倍数

HDL₃-C=上机测得结果×血清稀释倍数

HDL₂-C=HDL-C×HDL3

6．注意事项：

离心时间及速度一定要准确；

离心上清液混浊者应继续离心直到清亮止；

四、血清Lp（α）测定法

1．原理

血浆（清）中脂蛋白（α）（Lp（α））与Lp（α）的单克隆抗体（鼠）结合形成抗原抗体免疫复合物，有浊度改变，测定溶液界质中混浊度的光密度改变，求其血浆中Lp（α）的含量。

Lp（α）+抗人Lp（α）→抗原抗体复合物→测定光密度

2．试剂与仪器

试剂（第一化学）；Lp（α）缓冲液（R1）；Lp（α）抗体液（R2）。

仪器：生化分析仪（以CL-7200型为例）

3．操作方法

以△A=A₂-A₁进行运算Lp（α）浓度。

4．定标：

取Lp（α）定值液，用0.9%NaCl液稀释。

采用上述操作步骤，按免疫测定法定标，其操作方法及标准曲线如图16-3所示。

图16-3 Lp（α）免疫测定法的反应过程光密度变化值mAbs（A）及其检测的标准曲线图（B）（CL-7200型）

上机参数（以CL-72OO型为例）

5．注意事项：

（1）操作时，标本和试剂无需处理；

（2）血浆或血清标本均可检测。标本置2～21℃保存1周不变；

（3）标本浓度超过定标最高值时，应用生理水稀释后再测；

（4）抗体试剂（R₁）避免反复接触；

（5）测定时避免日光直接照射。

五、脂蛋白x的电泳分析

1．原理

血清脂蛋白x的组成中磷脂占66%，蛋白质仅占6%，在电场中因电荷少，选择电渗大小合适的琼脂为电泳支持物，则LpX向阴极移动，而其他蛋白质向阴极移动，从而达到分离的目的。用免疫沉淀法或聚阴离子沉淀法使其在琼脂板上沉淀，对于LpX阳性的血清可以在加样孔的阴极端见到白色沉淀带。

2、试剂

巴比妥缓冲液500mmol/L：pH8.6,离子强度0.05。

1%琼脂用上述巴比妥缓冲液加热配制。

沉淀剂；每升中含MgCl₂0.1mol，肝素2.5g及MaCl9g。

3．仪器：电泳仪。

4．操作：

（1）制板 1%琼脂糖加热未冷却前于一洁净载玻片上均匀铺开。凝固后在一端2cm～3cm处打孔（直径约2.5mm）。

（2）电泳　将血清20μl加于小孔内（勿使外溢和有气泡）。按琼脂糖脂蛋白电泳操作、搭桥、通电1mA、40min。

（3）浆琼脂玻片浸在沉淀剂中30min后观察结果（如Lp-x阳性，数min内即出现沉淀线），Lp-x浓度到3.3mg/dl上即可出现阳性反应。

正常值：正常人血清无Lp-x带。

（储建中　吴翠华）

（血浆脂蛋白的分离纯化及定量）参考文献

1．陈保生，脂蛋白的分离提纯，见：王克勤主编，脂蛋白与动脉粥样硬化，北京人民卫生出版社，1995：24～40

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6．KesslerA,Schumacher ,M,Wood WG,Immunoluminometric assays for the quantification ofapolipoprotein A I,apolipoprotein B,apolipoprtein C Ⅱ,apolipoprtein (a) andlipoprotein(a),Eur J Clin Chem Clin Biochem,1994,32:127

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8．李健斋，董军，以载脂蛋白组成作脂蛋白颗粒分类，中华医学检验杂志，1995，18：329-322

9．陈薇，胡汉宁，杨佳，915名正常人血清脂蛋白（a）水平的测定，医学新知杂志，1995，5：111-112。

10．张文武，洪嘉玲，许春玲，一种分离人血浆Lp（α）的简便方法，生物化学与生物物理学进展，1993，20：294-297

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12．WlicoxH,Heimberg M,Isolation of plasma lipoproteins by zonal ultracentrifugatino inthe B₁₄and B₁₅titanium roters.J Lipid Res,1970,11:7

第十七章　血清载脂蛋白分离纯化及其鉴定

研究载脂蛋白的前提条件是必须得到各种载脂蛋白的纯品，然而各种载脂蛋白的理化性质、分子量、氨基酸组成及其构象相差很大，因此必须根据各自的特性采用不同的方法进行分离纯化，才能达到获得纯品的目的。有关文献报导，目前分离纯化载脂蛋白方法和仪器种类很多，而常用的方法包括四个步骤即：①分离脂蛋白；②脱脂获得脂蛋白中的载脂蛋白部分即ApoHDL、ApoVLDL、ApoLDL等；③将各种载脂蛋白进一步纯化而获得免疫纯或单点纯；④鉴定或定量。

第一节　载脂蛋白分离纯化

一、分离脂蛋白

血浆是分离纯化脂蛋白的首选标本。从血浆（血清）中可分离得到CM、VLDL、LDL和HDL，再经脱脂除去脂蛋白中的脂质，剩下的部分为载脂蛋白的混合物。这一操作过程是获得载脂蛋白的最佳方法。

二、脱脂

由于各种脂蛋白含脂的种类和质量不同，脱脂剂组成略有差异。目前常用的几种脱脂方法有如下几种。

1．Warnick等法

将纯化的脂蛋白慢慢加入到预冷（-20℃）的丙酮：无水乙醇（1：1，V/V）混合液中，脱脂液的量为样品的20倍，不断搅拌，然后在-20℃冰箱放置过夜，4℃离心沉淀，将沉淀重复脱脂一次，用氮气吹干或真空干燥，脱脂物0℃贮存待用。

2．Scanu等法

将脂蛋白加入到预冷的（-15℃）无水乙醇：无水乙醚（3：2）混合液中，不断搅拌，以12h过夜，在-10℃或4℃离心（2000r/min），去上清留沉淀，再重复脱脂一次。用N₂或真空干燥，0℃贮存待用。

三、载脂蛋白的分离纯化法

（一）凝胶过滤法

凝胶过滤（gel filtration）技术是60年代兴起的一种简便有效的生物分离纯化方法。当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，因凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻于外部，在过滤的过程中，溶液中的物质按不同分子量筛选分开，达到分离纯化的目的。这一技术又称为分子筛层析，或者称为凝胶层析。

凝胶是不溶于水，在水中却有较大膨胀度和较好的分子筛功能的一类化合物。目前主要有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex），天然琼脂糖凝胶（商品名为Sapharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel），其后还发展了凝胶的各种衍生物，如羧甲基-交联葡聚糖（CM-Sephadex），二乙基氨乙基-交联葡聚糖（DEAE- Sephadex）等种类。

由于凝胶过滤技术设备简单、操作方便，重复性能好和样品得率高等特点。广泛应用于生命科学领域，如蛋白质、核酸、多糖氨基酸、激素和抗生素等物质的分离纯化。凝胶层析在载脂蛋白的分离纯化中，属于使用最多的技术手段。

凝胶过滤装置种类很多，其基本操作过程大同小异，操作步骤主要有：①凝胶种类的选择，按被分离物的性质及分子量大小而定；②凝胶柱的制备；③加样与洗脱；④分部收集透析，浓缩。

载脂蛋白分离纯化，多采用SephadexG-200层析分离。

1．ApoAⅠ、AⅡ的凝胶过滤分离纯化法：①超速离心获得HDL，以醇：醚（1：1）脱脂，-10℃脱脂6～8h，离心，弃上清留沉淀；②以6mol/L尿素Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH8.5)溶解沉淀；③加样于SephadexG200凝胶柱。以6mol/L尿素Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L,pH8.5)洗脱；④洗脱液经紫外监测仪（280nm）监测后，由部分收集器按吸收峰分部收集；⑤对各组份进行鉴定，收集需要的蛋白峰，透析，浓缩。

2．ApoE、CⅡ、CⅢ的凝胶过滤分离纯化法：

ApoE、CⅡ、CⅢ均以VLDL为材料，与ApoAⅠ类同的方法进行凝胶层析分离。

（二）亲和层析法

亲和层析是60年代末发展起来的一项分离纯化技术，目前已得到广泛的应用。亲和层析的原理与抗原对抗体、激素对受体和酶对底物等特异性反应的机理类同，每对反应物之间都有一定的亲和力。亲和层析是把被识别的分子（底物、配体或抗原）以共价键结合到含有活化基团的固相载体例如琼脂糖珠上，然后使含有欲分离的大分子化合物的混合液从这个载体滤过，极大部分对配体没有亲和力的化合物，均顺利通过载体而不滞留，欲分离的大分子能识别配体（有亲和力）并与其结合，而滞留在层析柱上，等所有杂质从层析柆上流走后即第一个层析峰出现后，改变洗脱条件，促使结合在配基上的大分子化合物解离下来并形成了第二个层析峰，原来混合液中欲分离的大分子化合物则以高度纯化的形式在流出液中出现，得到需要分离纯化的物质。亲和层析法几乎适用任何可以纯化的大分子化合物，如酶、抗体、抗原、激素、药物、核酸、维生素结合蛋白质，转运蛋白、阻抑蛋白、载脂蛋白和其他调控成分等。

亲和层析操作过程简述如下。

1．载体的选择

选择亲和层析所用的载体必须符合的条件有：①非特异性吸附要低；②有良好的流动特性；③在pH离子强度和变性剂浓度较大改变的情况下，化学和机械等理化性能稳定；④具备大量能被活化的化学基因；⑤高度有效的多孔结构。实际工作中，尤其是载脂蛋白的分离纯化多用琼脂糖珠（Sepharose 4B）作为载体选用。

2．配体（配基）的选择

亲和层析应根据被分离纯化的物质的理化性质和生物学性质而选择配本，一般考虑选择的条件是；①与纯化的物质有较强的亲和力。作为载脂蛋白的纯化常常选择Apo的相应抗体作为配体；②具有与基质共价结合的基团。

3．配体与载体的联结

配体与载体共价联结的方法包括：①载体功能基团的活化；②配体与活化基团的联结。使二者进行联结的化学反应必须足够温和，使配体和载体均可耐受而不发生变性。

配体与载体的联结方法有物理和化学的两类。最常用的方法是化学法，化学法包括偶联法和交联法，又以交联法常用，常用的化学试剂溴化氰（CNBr）环氧氯丙烷，双环氧乙烯、丁二烯砜和亚氨二乙醇等，用其活化的载体与配体偶联。或者使载体与配体螯合起来进行联结。

载脂蛋白纯化的常用方法是溴化氰偶联法，其操作过程包括：①活化，取一定的贮存载体Sepharose 4B用布氏漏斗抽干，加入等量的蒸馏水，并与等量的2mol/L的Na₂CO₃溶液（pH11～12）混匀。另取固体CNBr50～300mg/g贮存胶溶于二甲基甲酰胺溶液中，随后迅速加到搅拌的Sepharose 4B悬浮液内进行活化，其pH始终保持11～12范围。反应过程中因为放热，故要用碎冰置于反应杯周围控制温度在20℃左右，维持8～10min后再加碎冰，使其反应物温度制冷至4℃或更低的温度。由于活化的Sepharose 4B破坏迅速，他的半寿期在4℃约为15min，故整个操作过程必须迅速进行，以期尽快完成。将活化的Sepharose 4B反应液迅速转到布氏漏斗中，用10～20倍凝胶体积的预冷水及0.07mol/L溶液（pH8.3）洗涤。②偶联，经活化的洗涤过的载体与等体积的0.20～025mol/L碳酸盐缓冲液(含0.5mol/l NaCl)混合，每ml约含配体如抗人ApoB₁₀₀-IgG100μg溶液（pH8～10）混合，缓慢搅拌2h（室温）或4℃搅拌过夜，使载体与配体充分偶联而形成固相载体。偶联后在溶液中加入Tris-HCl溶液（pH8.0），静置2h，室温下洗涤以除去过剩的配体（抗人ApoB₁₀₀-IgG）；③配体结合量的测定：配体结合量一般以每毫升或每克贮存胶偶联配体的量表示，其数值可用作决定亲和吸附剂实际用量的参数采用直接测定法或间接测定法测定结合量；④亲和层析：将制备好的吸附剂CNBr-Sepharose-4B-配体（抗人ApoB₁₀₀-IgG）悬浮于平衡缓冲液中，然后加到装有平衡缓冲液的垂直层析柱中，待形成层析床后，以缓冲液平衡层析柱，再将混合组份的样品上柱，经一定时间后，让亲和物与固相上的配体亲和结合，尔后用一定盐浓度的缓冲液洗去无亲和力的无关组份。再洗脱结合的相亲和物，因亲和物与配体的结合虽然是非共价键结合。但比较牢固，一般缓冲液不能使其分开，此时必须在洗脱液中加入一定浓度的特殊化合物，一般采用破坏配体亲和物结合键的化合物如用3mol/l NaCl或3mol/L的硫氰酸盐或pH2～3的缓冲液可破坏抗原和抗体之间的结合，使抗原与固相抗体（或抗体与固相抗原）分离。若采用这一方法应立即除去硫氰酸盐或中和pH值等。

亲和层析柱可反复使用，一次使用后，必须将结合于固相载体上的亲和物全部洗脱干净，一般采用上述相同的洗脱液进行，再采用高浓度的中性盐溶液如0.5mol/l NaCl充分洗脱非特异性吸附于配体上的杂质，洗脱用缓冲液充分洗涤达到平衡后方可再度使用。在两次间隔期，如果时间较长，可加入柳硫汞或叠氮，钠等防腐剂以免细菌污染。

（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化法

电泳技术广泛应用于生命科学的领域里。在载脂蛋白的分离纯化中，电泳分离技术也是一种常被采用的方法。

因支持物的不同，电泳技术的种类有很多，本章着重介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳技术有关的操作。

1．SDS-PAGE连续电泳洗脱分离纯化法

利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），在规定时间内，混合液中的各种蛋白按分子量大小依次停留在凝胶的不同位置。再经染色脱色，即可见到多种蛋白区带，这是作为鉴定的SDS-PAGE法。如果SDS-PAGE不停地进行，含有多种蛋白混合液中的蛋白质会按小分子到大分子的顺序，使蛋白质进入阳极电极液中，若能设法分部收集从凝胶中电泳出来的各种蛋白质即可达到分离纯蛋白质的目的。

BIO-RAD公司推出一种聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质或核酸的装置，如图17-1所示。该仪器利用连续洗脱电泳技术原理设计。电泳期间，蛋白质或核酸在电场中，迁移到凝胶基质，他们被分成环形的区带，各个区带依次迁移到凝胶底部，然后直接进入洗脱室，洗脱室由聚乙烯材料组成，并贴有透析膜，下面再衬以支持网。在蠕动泵推动下，洗脱液呈辐射状流入位于冷却柱中心的洗脱管中，经紫外监测后流入分部收集器。按吸收峰收集相应组份，即可得到被分离的蛋白质。

图17-1 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离装置

为了达到分离纯化的目的，必须注意以下三方面的问题：

（1）凝胶孔径的选择：凝胶孔径主要受总浓度T%（Arc+Bis）的影响，一般是T%越大，孔径越小，其机械强度越强。当T%固定时，Bis浓度在5%时，孔径最小，高于或低于5%时，孔径都相应增大。最优分离效果的凝胶孔径必须保证其相对近移率（Rf）在0.55～0.6之间。

（2）凝胶长度的选择：适当的凝胶长度可以提高待分离蛋白质的分离效果，过长易导致蛋白区带扩散，过短则达不到分离效果。最适凝胶长度主要考虑待分离蛋白质与其相邻近的蛋白质分子量之间差异的大小（△MW）,△MW与凝胶长度呈反比关系。另外还应考虑上样量的多少，适当减少上样量可达到更好的分离效果。

（3）凝胶柱大小的选择：选择凝胶柱大小主要决定于制备上样量的多少以及待分离蛋白质与其邻近蛋白△MW。Bio-RAD电泳仪有配套的28mm、3.6cm²和37mm的8.2cm²过滤柱。

（4）蛋白质电泳的洗脱时间：主要维持Rf 0.55～0.60之间，凝胶柱越长，洗脱时间越长。也可以根据实际经验选择洗脱时间。

根据作用分离制备ApoAⅠ及碱性蛋白的经验，上凝胶柱电泳前，应将血清分别作适当的处理，如分离ApoAⅠ时，在血清采用肝素锰沉淀，留下含HDL的组份；分离碱性蛋白时，先用冷乙醇处理，留下含碱性蛋白的组份。电泳分离纯化前对血清作预处理，是分离成功的关键步骤。

2．聚丙烯酰胺凝胶（PAG）切割纯化法

这一方法利用SDS-PAGE，使分离不同分子量的蛋白质，依据待分离的特定蛋白质的位置，进行切割，再捣碎其凝胶，使蛋白质析出，而达到分离纯化的目的。笔者以此方法已分离纯化了ApoBⅠ、ApoE等蛋白质。方法简便易行，缺点是回收率较低。

（四）等电聚焦分离法

等电聚焦（lsoelectro focusing ,IEF）又称为等电点分离法，是利用一种含载体两性电解质（carrier ampholyte）的凝胶在电场中形成pH梯度，同时把具有两性电解质性质的样品（如蛋白质）聚集在他们的等电点相应的pH区带中，从而达到分离蛋白质的目的。

等电聚焦，是1966年建立起来的一种高分辨率的蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度载体中进行蛋白质的分离分析或纯化。

1．原理

等电聚焦技术必需的物质是两性电解质。在支持物（聚丙烯酰胺或琼脂糖）中，必须要有一个稳定的线性的pH梯度，形成这一线性pH梯度的物质就是两性载体。Rllbe早期发现谷胺酸、组氨酸和赖氨酸均能产生大约1pH的梯度，但pH范围太窄，且缓冲能力不够，因为蛋白质分子本身也是两性电解质，在电泳时，他会影响梯度pH值，为此，要求形成pH梯度的物质必须有足够的缓冲能力来克服蛋白质的影响。另外，还要求两性载体电解质必须有一个好的、均匀的导电性，使其整体系中保持电流畅通。1966年Vesterberg合成了一种两性载体物质，即由许多脂肪族的多羧基多氨基的异构体和同系物组成的混合体，利用调节胺和酸的比例可得到含氨基与羧基不同比例的脂肪族多氨基多羧基。两性电解质的pI值将在大多数羧基的pK值和大多数氨基的pK值之间，多乙烯多胺链愈长，两性电解质的pI值也越连续，即可获得平滑的pH梯度。如图17-2所示。

图17-2 平衡时载体两性电解质的浓度分布与pH梯度

两性载体必须具备下述条件：

（1）较强的缓冲能力及可溶性：聚焦过程中，为了防止蛋白质引起pH梯度的pH局部改变，保持pH梯度的稳定，两性载体必须具有较强的缓冲能力，特别是在被分离的蛋白等电点范围的缓冲作用。

（2）具有好的均匀导电性：在等电聚焦中，对等电点处必须有足够的电导，并要求各部位是均匀导电，若局部电导过小，有可能产生极大的电压降，局部发热，不仅影响pH梯度，且易使蛋白质产生热变性作用，使凝胶烧坏。

（3）两性载体本身紫外吸收值低：不与被分析的蛋白质起化学反应。

（4）无生物学效应：该物质对组织细胞及抗原的免疫性均无影响，也就是说若有少许两性电解质混入被分离的蛋白质中，并不影响其任何生物学功能。

载体两性电解质，分子量在300～1000之间，其pK和pI值各不相同但相互接近，pH范围在2.5～11之间，有pH范围不同的各类载体两性电解质，瑞典LKB公司的商品名称为“Ampholine”。

蛋白质是一种两性电解质分子，当他在大于他的等电点的pH环境中，就解离成带负电的离子，在电场中就泳动到正极；当他在小于他们的等电点的pH环境中，他变解离成带正电荷的离子，在电场中向负极泳动，这种泳动作用到达他的等电点的pH环境中，即他的净电荷为零时才停止，此时带电分子在电场作用下的迁移运动与扩散运动达到平衡。如果在一个pH梯度的环境中进行这种两性电解质（如蛋白质）的电泳，由于各种蛋白质的等电点不同，就能把不同蛋白质的分子按他们的等电点集中和分离在不同的区带中。

图17-3 蛋白质的分离模式图

箭头代表移动向，箭头长短代表移动速度，

右图为平衡时蛋白质的分离状态。

现设有等电点不同的载体两性电解质a、b、c、d、e、f混合液，在电场中泳动，pI最低（即最酸的）的a（等电点为pI_a）集中在最接近阳极的部位，经浓缩缓冲后，a处于等电状态（a的实际电荷为零），这部分pH与pI_a一致。仅高于a等电点的b（等电点为PI_b）同样向正极电泳，但无法跨越a接近正极，与a比较，b带正电荷，仅停留在a的负极端，这一部位的pH与pI_b一致。同理c停留在b的负极侧……，f在最负极端。经此电泳后，使这许多pI不同的载体两性电解质形成了从正极到负极分别为pI_a-pI_b-pI_c-pI_d- pI_e-pI_f的pH梯度。同时这些载体两性电解质具有足够的缓冲能力，使被分离的电解质不致于影响局部的pH值。又设有不同等电点的三种蛋白质A、B、C，在两种电极液分别为酸、碱的电场中泳动，A、B、C各自向自己等电点相同的pH部分移动。使电荷消失，停止移动，即A、B、C各自停留在与pI_A-pI_B-pI_C相同的pH部位，从而达到分离蛋白质A、B、C的目的，如图17-3所示。本方法装置简单，分辨力强，分离效果及重复性好，即可用于分离精制，也可作分析用，对标本纯度要求不严，但必须无盐存在。

在等电聚焦中，分离仅仅决定于蛋白质等电点，这是一个“稳定”过程，一旦蛋白质到达他的等电点位置，失去净电荷，该蛋白质就不能进一步迁移停留在与某一蛋白pI相同的pH值位置。等电聚点的最大优点是具有浓缩效应（或称为聚焦效应），可以对抗扩散，因此可以产生细窄稳定的蛋白区带。在这种电场中，蛋白质即使会扩散，由于是处于等电聚焦系统中，电极之间的pH梯度也是线性和连续的。如果蛋白带向阴极扩散，则将进入高pH范围而带负电荷，阳极就将吸引他回去，直到他回到净电荷是零的位置。如果他向阳极扩散，则将带正电，阴极将吸引他回到净电荷是零的位置。因此蛋白质只能在他的等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的区带，如图17-4所示。

图17-4 IEF-PAGE图（平板电泳）

等电点分离包括三个步骤：①载体两性电解质在电场中形成pH梯度；②两性电解质（如蛋白质）经电泳分离停留在不同的pH区域；③被分离的两性电解质的鉴定和等电点（pI）的测定。

2．等电聚焦-聚丙烯酰胺圆盘电泳（IEF-PAGE）

（1）装置与仪器：

电泳仪：与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同。

凝胶用玻璃管：5×65mm或5×120mm，作为做管状凝胶用，以下以管状凝胶为例。

（2）试剂：

以上配方可制成最终浓度为7.5%凝胶，供分子量10万以下的蛋白质如ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅡ、CⅢ、E、H等分离纯化或鉴定使用。分子量大于10万的蛋白质可用T=3.5%～5%、C=4%～5.5%的凝胶。

（3）操作：

制胶：取C液10ml，加双蒸水10ml，混合（冷天减压排气），充填到准备好的玻璃管距离项端5～10mm高，静置待凝。

加样：将已聚合之凝胶管上层水除去，置于电泳槽内（如图17-5），2mA/管预电泳30min，上槽接极，下槽极，使凝胶内形成pH梯度，预电泳毕，取出凝胶管，倾去管内H₃PO₄液并用水洗胶面，再按图加样、电泳。

图17-5 IEF装置与标本溶液的装置（园盘电泳）

电泳：电压300～350V，2mA/管，3h，如发热，可置5℃低温环境进行，也可在200V电泳4～5h。

（4）pH梯度测定：

按聚丙烯酰胺凝胶电泳法小心推出凝胶，浸入5%TCA（10m/gel）使分离层固定，每隔1～2h换液一次，共5次，以除去载体及固定蛋白质，再按聚丙烯酰胺凝胶电泳法所述之染色，脱色。

在IEF电泳中，带两根不加标本的凝胶管，电泳毕，将凝胶剥下，按5mm之间隔切断（两根并拢同时切）分别置于0.5～1.0ml双蒸水中浸泡过夜（4℃），分别测出pH值，作图，即得pH梯度曲线。

同时电泳的加有样品的染色凝胶分别测出色带位置，从pH梯度曲线中求出该蛋白之pI。

3．等电聚焦-聚丙烯酰胺平板电泳（IEF-PAGE）

（1）仪器与试剂：

仪器 水平式电泳槽、电泳仪、有机玻璃框架、玻璃板、酸度计、光密度计。

（2）试剂：

凝胶贮存液（Acr30g、Bis0.3g，加水到100ml。）、0.35%过硫酸铵、TEMED、20%载体两性电解质（pH4～10或pH4～7）、固定液（甲醇150ml、水350ml、磺基水杨酸17.25g、三氯醋酸57.5g）、染色液（考马氏亮兰R-250约0.115g溶于100ml脱色液）、脱色液（乙醇500ml、醋酸160ml、加水到2000ml）、1m H₃PO₄、1M NaOH。尿素、1%琼脂糖液。

（3）操作：

制备聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦薄板

将10.0×7.6×0.2cm的有机玻璃框架置于相应大的玻璃上，用滴管吸少量煮溶的琼脂糖液，滴入有机玻璃框架与玻璃之间、待凝。防止漏水。

制胶：以测定ApoC的PAGE-IEF为例，将下述试剂放入50ml量筒内。

加蒸馏水到20ml后，搅溶尿素，再加TEMED24μl，充分混匀后，迅速倒入装置好的有机玻璃框架内，再仔细盖上一块同样大的玻璃，待凝。

预电泳：电泳槽的电极液分别为1M H₃PO₄（+）、1m NaOH（-），四层滤纸搭桥，160V电压下电泳40min。

加样、电泳：以0.5×0.4cm大的小滤纸片间隔1.5cm距离插入凝胶内，用微量注射器分别取待测样品（蛋白质混合液）30μl，慢慢地分别点加在各小滤纸片上，以160V电压电泳约14h。

（4）pH梯度的测定：

电泳毕，取出凝胶板，沿正极到负极方向，平等切断1cm宽的凝胶块，按0.5cm长距离从正极到负极依次切下胶带，并按顺序分别装入已编有号码（1→14）的小桡坏杯内，各加双蒸馏水1ml，振荡，静置于冰箱过夜（或2h），次日取出，平衡至室温后，用pH计测定各胶片浸出液的pH值，以每片凝胶中心位置为原点，将各胶片中心位置对相应浸出液pH值作图，即得凝胶薄板上的pH梯度曲线。

准确测量剩下的凝胶板从[]→[]的长度（染色前长度），再浸入固定液固定1h，尔后将凝胶置于染色液染色3～5h，再用脱色液脱色至空白胶清晰为止，此凝胶可立即用光密度计扫描积分、定量，也可以干燥后保存。

测量染色后凝胶长度，求变形系数

变形系数=染色前胶长度/染色后胶长度

再量取凝胶正极端到染色区带的距离，乘以变形系数，就等于染色区带在染色前凝胶上相应的位置。据此，可从pH梯度曲线上查出蛋白的等电点。pH梯度曲线如图17-6所示。

例如：染色前胶长（从到极）为7.0cm

染色后胶长（从+到-极）为7.8cm

变形系数=7.0/7.8=0.9

凝胶上的染色区带（蛋白质）到正极的距离为1.5cm

0.9×1.5=1.35

以1.35为横轴的数字查pH梯度曲线相当于pH4.8，此为该蛋白质的电点，即pI=4.8。

图17-6 IEF-PAGE的pH标准曲线图

4．载脂蛋白的纯化

等电聚焦技术对蛋白质的分辨率很高，若要用作纯品制备，可采用IEF-PAGE平板电泳。电泳完毕，从凝胶块正中或边缘切一小条（约0.3cm宽）先染色，确认待测纯品的区带位置，再将未染色的凝胶蛋白区带切下捣碎、浸泡，浸泡液中即可得到蛋白纯品。用IEF纯化蛋白质，一定要在电泳之前先处理一次得到粗制品，再行电泳。该法成本较高，得率较低。

第二节　载脂蛋白纯品的鉴定

载脂蛋白分离纯化后，获得了所需要的纯品，该纯品纯度及其品种可通过下述方法进行鉴定。

一、免疫电泳法

免疫电泳法既可用于鉴定蛋白种类，又可鉴定其纯度。

制备1%的琼脂糖，以0.1mmol/L巴比妥缓冲液（0.05μ,pH8.6)为溶剂，制作一块约7×4cm的大小，厚度为0.2～0.3cm的琼脂糖凝胶，以玻璃板或薄膜为支持物，于凝胶正中打孔（直径0.2cm）。1孔加全血清5μl，2孔（中间孔）加纯化的某产品，3孔加已知某载脂蛋白。电泳电极液为0.05μ，pH8.6的巴比妥缓冲液。当标本前沿泳动到距离凝胶端1cm左右，停止电泳，取出凝胶板，在凝胶板三孔之间开两条宽0.2cm，长5～5.5cm长的凝胶槽。1与2孔之间的凝胶槽（A槽）中加入羊抗人全血清抗体，2与3孔之间的凝胶槽（B槽）加入羊抗人某Apo单价特异抗血清，将凝胶板置于含少量水的大平皿中，加盖，水平置于37℃培养箱24h，再观察弧形白色沉淀线，与A槽沉淀线位置比较若位置完全相同，初步可以确认为2孔纯化产品与3孔标准蛋白是同一蛋白质，如图17-7所示。

图17-7 免疫电泳图（琼脂糖凝胶）

A：1、2、3分别为抗人ApoAⅠ血清（第一化学）、抗人全血清，抗人ApoAⅠ血清（自制）；a、b、c、d分别为ApoAⅠ纯品（纯化产品）、人血清、人血清、ApoAⅠ纯品（sigma）

B:1、2分别为抗人全血清，抗有ApoB血清（自制）：a、b、c分别为人血清、人血清和人ApoB纯品（自制）

二、免疫火箭电泳

按本章节的方法进行操作，若为单一火箭沉淀峰，也可判纯化产品为单一蛋白，如图17-8所示。

三、免疫双扩散法

制备1%琼脂糖凝胶（0.05μ，pH8.6的巴比妥缓冲液为溶剂），按图打孔。图17-9中孔加入已知某Apo单价特异羊抗人血清，周边第1孔加纯化产品，第2孔加已知某Apo纯品，置37℃培养箱24h，若第1与2孔旁两条白色沉淀线相互融成一个弧形，无分叉，表明1孔与2孔的蛋白质与中孔抗血清的抗有相同的抗原性，可确认为同一蛋白质。

17-8 免疫火箭电泳图

A：琼脂糖凝胶板含抗人全血清、抗原孔含人ApoAⅠ纯品；

B：琼脂糖凝胶析含抗人全血清、抗原孔含人ApoB纯品。

图17-9 各种抗原抗体系的沉降线示意图

1，2：同一抗原抗体系（complete identity）

3：不同的抗原抗体系（nonientity）

4：部分相同的抗原抗体系（partialidentity）

四、等电聚焦电泳

利用IEF-PAGE测等电点，根据等电点确认蛋白质性质。

五、蛋白质分子量测定

从化学观点考虑，分子量是组成蛋白质分子的各原子量总和。但是，对大分子的蛋白质来讲，若不知道分子量也无法得知每个分子的元素组成情况。为此，人们在蛋白质的研究中，对测定其分子量工作极为重视，先后用于测定蛋白质分子量的方法有渗透压、粘度、光散射、蛋白质氨基酸序列分析法、超速离心（沉降速度或沉降平衡）、凝胶层析和SDS-PAGE等法。载脂蛋白分子量测定多采用超速离心沉降速度法、凝胶层析法和SDS-PAGE法。

凝胶法层析用：1gM=A-B（V_e/Vo）

SDS-PAGE用：lgM=A-BR_f

式中，对已知标准样品，x和y分别为实验值和已知值。n是实验的点数。采用上述两个方程，由已知样品的数据，可以求出标准线的两个常数A、B值。对未知样品，只要测出x，利用A、B值可以计算出y值。总之，从实验测得的数据计算该实验方法所用方程的常数，再用这个常数计算出未知样品的分子量，所得结果比作图法精确，且很方便。

下文仅介绍SDS-PAGE作图法测定蛋白质的分子量。

十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）是一种阴离子去污剂，于100℃加热，在β-巯基乙醇存在下，可以使大多数多聚体蛋白质的四级结构解体，并与各亚基牢固地结合，从而遮蔽了蛋白质分子上原有电荷，同时带上强的负电荷。

由于所有的SDS-蛋白质复合物（图17-10），在电泳时都以同样的电荷按分子量大小不同向正极移动，作SDS聚丙烯酰胺凝胶泳动（SDS-PAGE）时，其泳动速度仅决定于蛋白质的分子量。SDS与蛋白质的结合是成比例的，所以SDS-蛋白质复合物在泳动中的不同速率，就反映了分子量的不同。与分子量的对数和相对迁移率成一定比例关系。使用已知分子量的标准物作标准曲线（图17-11，图17-12）或用计算法确定标准曲线的常数，即可求出未知样品的分子量。用这种方法测定的分子量是亚单位肽链的分子量。

图17-10 SDS对蛋白质四级结构的破坏作用，SDS与亚基牢固地结合，遮蔽了蛋白分子的原有电荷

实验结果也可以通过公式运算求蛋白质分子量：

先求得迁移率Rf，Rf=d_e/d_o

d_e为样品迁移距离，d_o为前沿迁移距离（染料）

从几种标准样品的Rf值和分子量对数，用最小二乘法能准确地求得a、b二常数，从而可进行未知物分子量的计算。

图17-11 人ApoAⅠ分子量测定图（SDS-PAGE）

图17-12标准蛋白质分子量测曲线（SDS-PAGE）

1为蛋白质标准分子量（LKB）：

2为ApoAⅠ纯品（Sigma）；

3为ApoAⅠ纯品（自制）

SDS-PAGE的分子量测定简要步骤是：①制备4%～30%的聚丙烯酰胺梯度凝胶；②待测蛋白纯品和标准分子量标本的制备，按蛋白样品1mg/ml浓度溶于含有20%蔗糖的电极缓冲液中，加入5μl0.1%溴酚兰作指示染料，取50μl上样；③电泳：电极缓冲液（有多种），含1%SDS；④染色脱色：考马斯亮兰R-250染色，脱色；⑤制作标准分子量曲线；量取从原点到前沿溴酚兰及原点至各条蛋白区域的距离。计算各自标准蛋白的Rf值，以LogMW对相应的Rf作图，绘成标准分子量蛋白曲线如图17-8、图17-9所示，以待测蛋白质的Rf值在标准曲线上得到LgMW值，计算待测Apo纯品的分子量。

测定分子量的SDS-PAGE法主要优点是快速，样品用量少，可同时测定几个样品。缺点是误差较大，误差主要与电泳蛋白区域移动距离测量是否有关。

SDS-PAGE法测定的是亚单位肽链的分子量。常用的标准蛋白质如表17-1所示。

表17-1 标准蛋白质及其分子量

六、双相电泳

血浆或组织中有成千累万种蛋白质，等电点近似，分子量大小类同的蛋白质很多，若仅单一测蛋白质的pI或分子量，还不足以说明是某一的蛋白质，可能是也可能不是。如果既测定pI，又测定分子量，利用这两种参数鉴定蛋白，其确认的准确率将得到很大的提高，因为这两种参数都相同的蛋白质的概率是很小的。为此常采用双相电泳技术即第一相为IEF-PAGE，另一相为SDS-PAEG，进行蛋白质的鉴定。

七、蛋白质化学组成分析

末端氨基的分析，是鉴定蛋白质纯度的方法之一。一条肽链的蛋白质，通过N-末端的定量分析，每克分子蛋白质应当有整数克分子的N-末端氨基酸，少量其他末端氨基酸的存在，常常表示存在有杂质。

分析蛋白质各种氨基酸百分比，也可作为蛋白质各类鉴定的参考值。

最终的纯度标准，应当是氨基酸顺序的测定。

第三节　蛋白质浓度的测定

蛋白质溶液浓度测定方法有多种，下述几种方法可供选用。蛋白质浓度的测定，往往用于计算纯化方法的回收率的重要方法。

一、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛采用。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期价段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu²⁺与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

二、Lowry法

此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu⁺⁺与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu^2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2^+-蛋白质络合物所还原。

三、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算：

是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。

此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为0.1%的各种蛋白质在280nm处的消光系数（）在0.5～2.5之间变化。

所有的蛋白质在230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的α^0.1%在225nm和215nm处分别为5.0和11.7，而在280nm处测为0.58。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此，此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为10μl/ml～100μl/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：

光密度之差求

得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。

（吴翠华　贺小玲　周新）

（血清载脂蛋白分离纯化及其鉴定）参考文献

1．周新，张华征，殷以礼等.抗人载脂蛋白B血清的制备及其临床应用.中华心血管病杂志，1986，14：135～137

2．周新，张华征，韩豫.人血清载脂蛋白C的分离与定量.科学通报，1984，29：437～440

3．周新，付湘微，贺小玲等，AopAⅠ的凝胶切割纯化法及其抗血清制备的研究.湖北医学院学报，1990，11：200

4．Neville DM ,et al ,Moecular weightdeterminationof protein dodecyl sulfate complexes by gel electrophoresis in adiscontinuous buffer system,J Biol Chem,1997,246:6328-6330

5.EdwardS,Golub,Immunology:a synthesis monoclonal and hybrid antibodies.Sinauerassociates lNC.pubishers,1987:95-97

6.lewisLA.Naito HK,Handbook of electrophoresis,VolunmeⅣ,CRc Press,Boca Raton Florida,1983

7.CheungMC,Albers JJ,The mesaurement of apolipoprotein AⅠand AⅡ level in men and women by immunoassay.J ClinInvest.1977,60:43-50

8.Utermann,G,FranceschiniG,et al.Genetic variants of a group apolipoproteins.Rapid methods for screeningand characterization without ultracentrifugation .J Biol Chem,1982,257:501-504

9.藤岡，原豐，岸均，他.SRIR法

第十八章　血清载脂蛋白的免疫测定

血浆中蛋白质种类繁多，对各种单一蛋白进行快速而又特异的定量。目前公认的方法是免疫测定法，即利用其特异的抗体，采用测定抗原抗体复合物的方式定量。血浆（清）中载脂蛋白是以脂蛋白形式存在的少量蛋白，在解联剂作用下，使载脂蛋白从脂蛋白中分离出来，再利用相应的载脂蛋白抗体进行测定。

载脂蛋白的免疫测定方法很多，目前采用的方法各有其特点，所需条件也有差异，现将医学检验中常用的定量方法作一简要介绍

第一节　血清载脂蛋白定量的方法学及其参考值的评价

一、载脂蛋白测定方法

1．单向免疫扩散法（radialimmunodiffusion,RID）

该法较简单，一般实验室均可进行。消耗较多的抗血清，扩散过程至少24h，最多需72h，测定下限值为10μg/ml。该方法虽然简单，应严格控制有关条件如：含抗血清的琼脂糖凝胶厚度要均匀；加入小孔的稀释抗原（血清）量要准确；含ApoB的脂蛋白如VLDL和LDL颗粒大小不一，如琼脂糖凝胶浓度在1.5%～2.0%,可能仅测出LDL的ApoB，大颗粒的LDL及VLDL的ApoB可能无法测出，因为难以穿过琼脂糖凝胶的孔隙。另外，扩散过程中，凝胶板一定要水平，否则易使扩散环呈椭圆形，难以准确测量直径。一般使沉淀环以3.5～10.0mm为宜，应在两个方向测量直径，其精度要求达到0.1mm。采用五种不同浓度参考值，测定沉淀环面积对相应浓度关系以曲线回归方程作图。

2．电免疫测定法（electroimmunoassay,EIA）

该法灵敏，抗血清用量少，如琼脂糖缓冲液中加入聚乙二醇及甘氨酸，其电泳时间可缩短一倍，火箭峰高以1～4cm为宜，火箭峰的测量可以计算面积或峰高，峰高从中心量起。测量精度最好能在0.1mm,灵敏度约2μg/ml，又称为火箭电泳法。

3．免疫比浊法(immunoturbidimetryassay,ITA）

简便快速，在自动分析仪进行操作并能批量检测，是目前临床使用最多的方法学。免疫比浊法有两种：一是测定光散射的，又名免疫散射比浊法（INA）；需用特殊的激光浊度仪；另一种是利用光度计测定通过混浊溶液后的透光强度，称为透射免疫比浊法（ITA），其灵敏度低于INA。比浊法可以终点法和速率法测定，速率法是根据散射光强度与时间的关系，以微机处理计算出抗原抗体复合物形成的最大反应速度，后者与溶液中抗原量成正比，常可在1min内完成测定过程，可自动扣除空白；终点法比速率法稳定，一般多用终点法。

4．酶联免疫法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）

该技术已广泛应用于极微量蛋白的定量测定，可测出ng级水平的抗原或抗体含量，该法可用于ApoE、C-Ⅱ、C-Ⅲ等含量较少的载脂蛋白的定量测定。

5．放射免疫法（radioimmunoassay,RIA）

该法灵敏，抗血清用量少，所需设备较多，一般用¹²⁵I标记抗原作为示踪物，除ApoC-Ⅰ（不含酪氨酸）以外，都可以作碘标记（氯胺T法），以双抗体法测定RIA法可检测最低至3～5ng。临床检验中不常用此法，主要用于动物实验的科学研究工作。

还有荧光免疫法和化学发光法等灵敏度很高的方法。

血清载脂蛋白测定的方法，从测定原理、方法学评价及参考值，刘秉文和李健斋等人作了大量的工作，为国内的载脂蛋白测定的临床应用奠定了基础。周新曾于1986年首先在国内研制成功抗人ApoB₁₀₀血清，其后，国内同仁陆续研制出ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、E、CⅡ、CⅢ抗血清，并广泛应用于临床的疾病诊断，在部分大医院已成为常规检查项目。

刘秉文在“脂蛋白与动脉粥样硬化“一书中全面总结了国内外载脂蛋白测定的方法学及其参考值，本节将引用如下比较表：

表18-1　ApoAⅠ免疫测定法的比较

P:多克隆抗体；M：单克隆抗体；RIA：放射免疫法；ELISA；酶联免疫法；RID：单向免疫扩散法；INA：免疫散射比浊法；ITA：免疫透射比浊法。

（源自：刘秉文，1995.）

表18-2 ApoAⅡ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-3 ApoAⅣ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-4 ApoB₁₀₀免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-5 ApoCⅠ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-6 ApoCⅡ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-7 ApoCⅢ免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

二、人血浆（清）载脂蛋白参考值比较

刘秉文于1995年对国人血浆（清）各项载脂蛋白参考值与国外参考值作了详细的比较，其报道见表18-9、18-10、18-11、18-12、18-13、18-14、18-15。

表18-8 ApoE免疫测定法的比较

（源自：刘秉文，1995.）

表18-9 国人血浆ApoAⅠ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

*：作者补充。

表18-10 国人血浆ApoAⅡ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-11 国人血浆ApoB含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-12 国人血浆ApoCⅠ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-13 国人血浆ApoCⅡ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-14 国人血清ApoCⅢ含量与国外报道的比较

（源自：刘秉文，1995）

表18-15 国人血浆ApoE含量与国外报道的比较