二、最适工作浓度的选择

在建立某一ELISA测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到最合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍最适工作浓度的选择方法。

（一）间接法测抗体

1．酶标抗抗体工作浓度的选择

（1）用100ng/ml人IgG进行包被，洗涤。

（2）将酶标抗人IgG用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。

（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸亮度（A），绘制曲线如图15-10。读取A值在1.0时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人IgG的工作浓度应为1/1600。

2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度

（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。

（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，保温，洗涤。

（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人IgG抗体，保温，洗涤。

（4）加底物显色。加酸终止反应后读取A值。

（5）选择强阳性参考血清的A值为0.8左右、阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表15-1为本例的测定结果，表中数字为A值。从表中可见1:200为最舒适的工作浓度。

表15-1 间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择

各类血清 抗原稀释度
1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
强阳性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42
弱阳性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19
阴性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05
稀释液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04

（二）夹心法测抗原

在夹心法ELISA法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下（表15-2）：

表15-2 夹心ELISA包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择

包被抗体的浓度及酶标抗体稀释度 参考抗原
强阳性（25ng/ml） 弱阳性（1.5ng/ml） 阴性
10μg/ml
1:1000 1.17 0.15 0.09
1:5000 0.46 0.03
1:25000 0.12
1μg/ml
1:1000 ＞2 0.25 0.10
1:5000 0.91 0.12 0.01
1:25000 0.25 0.01
0.1μg/ml
1:1000 0.42 0.13 0.13
1:5000 0.11 0.03 0.02
1:25000 0.03

（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为10、1和0.1μg/ml，分别在ELISA板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。

（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。

（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如1:1000、1:5000和1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。

（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取A值。

（5）以强阳性抗原的A值在0.8左右、阴性参考的A值小于0.1的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表15-2可看出包被抗体浓度可选用1μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。