在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。双向扩散也可分为试管法和平板法两种方法。
（一）试管法
试管法由Oakley首先报道。先在试管中加入含抗体的琼脂，凝固后在中间加一层普通琼脂，冷却后将抗原液体加到上层。放置后，下层的抗体和上层的抗原向中间琼脂层内自由扩散，在抗原与抗体浓度比例恰当处形成沉淀线。此法分析效果与Oudin法相似，在临床检验中罕用。
（二）平板法
平板法由Ouchterlony首先报道，是抗原抗体鉴定的最基本方法之一。该法的基本步骤是：在琼脂板上相距3～5mm打一对孔，或者打梅花孔、双排孔、三角孔等（图12-5）。在相对的孔中加入抗原或抗体，置室温或37℃18～24h后，凝胶中各自扩散的抗原和抗体可在浓度比例适当处形成可见的沉淀线。根据沉淀线的形态和位置等可作如下3种分析。
1．抗原或抗体的存在与否及其相对含量的估计沉淀线的形成是根据抗原抗体两者比例所致。沉淀线如靠近抗原孔，则指示抗体含量较大；如靠近抗体孔，则指示着抗原含量较多。不出现沉淀线则表明抗体或抗原过剩。另外，如出现多条沉淀线，则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗体的纯度。
图12-5双扩散各种孔型图
2．抗原或抗体相对分子量的分析抗原或抗体在琼脂内自由扩散，其速度受分子量的影响。分子量小者扩散快，反之则较慢。由于慢者扩散圈小，局部浓度较大，形成的沉淀线弯向分子量大的一方。如若两者分子量相等，则形成。图12－6显示左侧沉淀线抗原分子量大于抗体，右侧沉淀线则抗体大于抗原，中间一条线则为两者相等。抗体多为IgG，分子量约15kD，未知抗原的分子量可做粗略估计。
图12-6抗原抗体相对分子量示意图
3．用于抗原性质的分析两种受检抗原的性质完全相同、部分相同或完全不同。三种情况在双向扩散中表现的基本图形见图12-7。
从图12-7可以分析出，左图中两种受检抗原（Ag-a）完全相同，形成一个完全融合的沉淀线；右图中抗体为双价，两种抗原完全不同（Ag-a和Ag-c）；中图的抗体为双价，两种抗原（Ag-ab和Ag-ac）皆有相同的a表位，又有不同的b和c表位，所以沉淀线呈部分融合的形状。这种技术作为抗原的分析，是目前免疫化学中最常用的鉴定技术之一。
图12-7三种扩散基本图型
4．用于抗体效价的滴定双向扩散技术是抗血清抗体效价滴定的常规方法。固定抗原的浓度，稀释抗体；或者抗原、抗体双方皆作不同的稀释，经过自由扩散，形成沉淀线。出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价。
